Etablering av realtime-PCR for påvisning av mecC hos meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA)

Abstract

MRSA er gule stafylokokker, Staphylococcus aureus, som har utviklet resistens mot nesten alle β-laktamantibiotika, og skyldes ervervelse av mecA- eller mecC-genet. Formålet med denne bacheloroppgaven var å etablere en TaqMan real-time PCR-metode for deteksjon av mecC hos MRSA. Dette var ønskelig blant annet fordi dagens metode med konvensjonell PCR er tidkrevende. I tillegg påviser ikke den nåværende metoden mecC-genet i ekstern kvalitetskontroll fra Quality Control for Molecular Diagnostics. Etableringen av real-time PCR for påvisning av mecC tok utgangspunkt i en tidligere publisert metode og ble optimalisert for bruk ved referanselaboratoriet. Metoden ble validert ved undersøkelse av sensitivitet, effektivitet og spesifisitet, både med og uten ROX som passiv referanse. I tillegg ble det undersøkt om metoden påviser mecC i den eksterne kvalitetskontrollen og om SYBR Green kan brukes som et alternativ til TaqMan. Den optimaliserte real-time PCR-metoden har høy sensitivitet (copy number/antall bakterier: 27,8) og effektivitet (98,0 %). Real-time PCR-metoden viser god spesifisitet, da resultatene for alle de 52 bakterieisolatene i valideringspanelet samsvarer med konvensjonell PCR. Alle de 29 bakterieisolatene som fikk påvist mecC-genet ved real-time PCR var ved fenotypisk resistensbestemmelse resistente mot cefoxitin. Dette tyder på overensstemmelse mellom real-time PCR og fenotypisk resistensbestemmelse med cefoxitin. Den optimaliserte real-time PCR-metoden påviser mecC-genet i ekstern kvalitetskontroll. Real-time PCR-metode med ROX gir en bedre baselinjebestemmelse enn tilsvarende metode uten ROX. Den optimaliserte real-time PCR-metoden er raskere å utføre enn den konvensjonelle PCR-metoden, og viser høy sensitivitet, effektivitet og spesifisitet. Dagens konvensjonelle PCR-metode for påvisning av mecC kan erstattes med TaqMan real-time PCR-metoden som er optimalisert i denne oppgaven.

MRSA is Staphylococcus aureus which has developed resistance to almost all β-lactam antibiotics, and this is due to the acquisition of the mecA or mecC gene. This bachelor thesis aims to establish a TaqMan real-time PCR method for the detection of mecC in MRSA. This is desirable because the current method of conventional PCR is time consuming. In addition, the current method does not detect the mecC gene in external quality control from Quality Control for Molecular Diagnostics. The establishment of real-time PCR method for mecC was based on a previously published method and was optimized for use at the reference laboratory. The optimized method was validated by examining sensitivity, efficiency and specificity, both with and without ROX as passive reference. In addition, it was examined whether the method detects mecC in the external quality control and whether SYBR Green can be used as an alternative to TaqMan. The optimized real-time PCR method has high sensitivity (copy number: 27,8) and efficiency (98,0%). The real-time PCR method shows good specificity, as the result for all 52 bacterial isolates in the validation panel correspond to conventional PCR. All of the 29 bacterial isolates found to be mecC positive by real-time PCR were resistant to cefoxitin by phenotypic resistance determination. This indicates consistency between real-time PCR and phenotypic resistance determination with cefoxitin. The optimized real-time PCR method detects the mecC gene in external quality control. Real-time PCR method with ROX is considered to provide better baseline determination than an equivalent method without ROX. The optimized real-time PCR method is faster to perform than the conventional PCR method, demonstrating high sensitivity, efficiency and specificity. The current conventional PCR method for detecting mecC can be replaced by the TaqMan real-time PCR method optimized in this thesis.