Bruk av lipasen Candida antarctica (Novozym 435) som biokatalysator for etanollyse av sild- og selolje, analysert ved 13C NMR spektroskopi, gasskromatografi og tynnsjiktkromatografi med flammeioniseringsdetektor

Abstract

De flerumettede omega-3 fettsyrene eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA) har fått økt oppmerksomhet på grunn av dokumenterte helseeffekter mot hjerte- og karsykdommer. Fettsyrene finnes normalt som etylestere eller triasylglyseroler i oppkonsentrerte fiskeolje produkter. Industrielt produseres fiskeolje produkter ved kjemisk transesterifisering, en prosess som krever høy temperatur og bruk av kjemikalier. Lipaser har i nyere tid fått gradvis økt oppmerksomhet på grunn av deres milde betingelser og spesifisitet ved bruk som biokatalysator under lipid modifikasjon. Denne oppgaven har som hovedformål å studere muligheten for å benytte lipase som biokatalysator ved transesterifiseringsreaksjon av sild- og selolje for produksjon av etylester. Den ikke-spesifikke immobiliserte lipasen Candida antarctica (Novozym 435) er benyttet som biokatalysator for reaksjonen. Reaksjonens progresjon er studert ved bruk av kjernemagnetisk resonans(13C NMR) som etter min beste kjennskap ikke er benyttet i stor grad for studie av etanollyse. Fettsyresammensetningen og fettsyreposisjoneringen på glyserolmolekylet til sild- og selolje er bestemt ved gasskromatografi (GC) og 13C NMR. Temperatur og etanolmengdens innvirkning og optimale betingelser er bestemt ved tynnsjiktkromatografi med flammeioniseringsdetektor (TLC-FID). I sild- og selolje utgjør enumettede fettsyrer den største andelen fettsyrer med henholdsvis 59 og 59% av totale mengde fettsyrer. De flerumettede omega-3 fettsyrene utgjør henholdsvis 16 og 23% for sild- og selolje. Selolje har fettsyrene EPA og DHA esterifisert til sn-1,3 posisjon ved >95%. Sildeolje har DHA esterifisert til sn-2 posisjon ved >95% og EPA esterifisert 49% til posisjon sn-1,3 og 51% til posisjon sn-2. Optimale reaksjonsbetingelser er funnet for etanollysereaksjonen med hensyn til temperatur og etanolmengde. Ved bruk av sildolje under støkiometrisk molarforhold etanol til olje er økende temperatur funnet å øke etylester dannelseshastigheten. Det er vist at 60oC gir en lavere reaksjonshastighet enn optimaltemperaturen 50oC. Dette kan forklares av redusert lipaseaktivitet som resultat av massetransportbegrensninger. Etanolmengdens innvirkning på etanollyse reaksjonen er funnet å gi økt etylester dannelseshastighet, ved økt mengde av etanol i systemet. Ved overskudd av etanol er det funnet at temperaturen ikke har samme innvirkning, som under støkiometrisk molarforhold etanol til olje. På bakgrunn av disse resultatene er 50oC funnet å være optimaltemperatur ved støkiometrisk molarforhold etanol. Ved overskudd av etanol er funnet at 30oC er den mest passende temperatur. 13C NMR er den eneste analysemetoden som gir multi-komponent informasjon i et steg. I denne oppgaven er teknikken benyttet for analyse av reaksjonsprogresjonen til etanollysereaksjonen under de optimaliserte betingelsene. Ved støkiometrisk molarforhold etanol til olje viser lipasen spesifisitet mot sn-1,3 posisjonene på glyserolmolekylet i sild- og selolje. For selolje viser lipasen høyere aktivitet mot fettsyren EPA enn DHA. Undersøkelsen gjort ved 50oC viser endring i sammensetningen asylglyserol gjennom reaksjonsforløpet fra 2MAG og 1,2DAG til 1MAG og 1,3DAG som kan forklares av intramolekylær asylmigrering. Analyse av reaksjonsprogresjonen til etanollysereaksjonen utført med overskudd av etanol og 30oC viser at lipasen fortsatt uttrykker spesifisitet mot sn-1,3 posisjonene på glyserolmolekylet. For selolje viser lipasen også økt aktivitet mot fettsyren EPA sammenlignet med DHA. Analysen viser imidlertid ikke endring i sammensetning asylglyseroler over reaksjonsforløpet noe som tilsier at det ved lavere temperatur ikke forekommer intramolekylær asylmigrering.