Transport av fenyl-lipid i Azotobacter vinelandii

Abstract

Ved lav næringstilgang kan Azotobacter vinelandii gå inn i et cystestadium, hvor en del av fosfolipidene i yttermembranen erstattes med alkylresorcinoler og alkylpyroner. Gener involvert i syntese av alkylresorcinol og alkylpyron har tidligere blitt identifisert, og lokalisert i operonet arsABCD. Like oppstrøms for dette operonet ligger tre hypotetiske gener, Avin_29510, Avin_29500 og Avin_29490. Tidligere studier har vist at disse genene uttrykkes samtidig som arsABCD. Funksjonen av Avin_29510, Avin_29500 og Avin_29490 ble studert i denne oppgaven, genene fikk henholdsvis navnene arsF, arsD og arsH. arsF, arsG og arsH ble isolert fra A.vinelandii (villtype) ved PCR, og inaktivert ved å klone tetracyclinresistens-genene tetA og tetR inn i genene. Tre muterte stammer av A.vinelandii ble konstruert, hvor villtype-genet ble erstattet med henholdsvis inaktivert arsF, arsG og arsH. Dette ble utført ved homolog rekombinasjon. Cystestadium ble indusert i de tre mutant-stammene, før uttrykk av alkylresorcinol kunne undersøkes ved en fargereaksjon. Det kunne ikke detekteres alkylresorcinol i cystemembranen til mutantene. Da tidligere studier har vist at verken tetA eller tetR fører med seg polare effekter av betydning, ble det konkludert med at både arsF, arsG og arsH er essensielle for uttrykk av alkylresorcinol. Ved en bioinformatisk undersøkelse hvor de hypotetiske genene blant annet ble sekvenssammenstilt mot gener i andre organismer, ble det vist at arsF koder for en ATP-bindene komponent i en ABC-transportør. Det ble også vist at ArsG har likheter med permease-proteiner i ABC-transportsystem, og at ArsH muligens også er del av en ABC-transportør. For samtlige av de undersøkte genene ble det funnet homologe gener involvert i eksport av lipoprotein. De samlede resultatene fører med seg sterke indikasjoner på at arsF, arsG og arsH er involvert i eksport av alkylresorkinol ved cystedannelse. For å kunne verifisere at utslått arsF, arsG og arsH er årsaken til den observerte endringen i alkylresorcinol-produksjon hos muterte cyster, ble det dannet transposonplasmider med villtype-gen under kontroll av en Pm-promoter. Disse kan senere benyttes til å komplementere mutantene. Komplementeringsarbeidet ble ikke ferdigstilt i dette studiet grunnet tidsmangel.