| dc.description.abstract | Bakterien Pseudomonas aeruginosa er en opportunistisk patogen som er et stort problem for personer med cystisk fibrose der den gir en kronisk lungeinfeksjon. P. aeruginosa blir også funnet i over halvparten av kroniske sår. Ved kroniske infeksjoner danner bakterien en biofilm og blir mer resistent mot antibiotika. Biofilm inneholder en overlevelesesstrategi for bakterier. En av de viktigste komponenter i biofilm er alginat. P. aeruginosa syntetiserer acetylerte alginat, hvor acetylgrupper beskytter sukkerenheter i polymeren fra degradering med alginatlyaser. Alginatlyase er et enzym som spalter alginat, og dette enzymet produseres av mange bakterier og alger. Alginat lyaser kan karakteriseres etter hvilken binding de spalter, og de benevnes dermedmannuronatlyaser (M-lyaser), eller guluronatlyaser (G-lyaser).
AlgL lyase fra A. vinelandii er en M lyase som har evne til å degradere deacetylert alginat. AlxMlyase fra Photobakterium sp. (ATCC43367) er en polyM lyase som bryter effektivt deacetylertalginat. De to lyasene ble koblet i denne oppgaven mot en deacetylase psmE (N) fra P. syringae for degradering av acetylerte biofilmalginat fra P. aeruginosa. Kloningen av algL-psmE(N) bleikke ferdig.
Ved hjelp av subkloning inn i en ekspresjonsvektor ble alxM-psmE(N) uttrykt i E.coli. Rensing av det uttrykte fusjonsprotein ble utført ved hjelp av anion ionebytterkromatografi. Den beste fraksjonen A9 viste en lyaseaktivitet 2 U/ml ved degradering av macrocystisalginat, og den spesifikke aktiviteten var 1,79 u/mg. SDS-PAGE viste masse bånd, men ingen bånd av ønsket størrelse ble observert. Forventede proteinstørrelse var 117 kDa.
Karakterisering av lyasen viste at den hadde et pH optimum ved 7,5. Det var økning av aktivitet i pH området 6,5-7,5 med omtrent 50 % av aktiviteten ved pH 6,7. Lyasen trengte høye saltkonsentrasjoner for å oppnå optimal aktivitet (0,25 M NaCl), men aktiviteten ble redusert til mindre enn 30 % ved 0,35 M NaCl.
Initiellaktivitet og nedbrytningsaktivitet i følge tid på deacetylerte og acetylerte polyM alginaterfra P. aeruginosa ble studert. Nedbrytningshastighet var 4 ganger høyere ved nedbrytning avdeacetylert alginat sammenlignet med 45 % acetylert alginat. Enzymet viste liten evne til å degradere 70 % acetylert polyM alginat. Nedbrytning av alginat over tid viste at det var aktivitet ved nedbrytning av 25 % (G) alginat fra P. aeruginosa med 30-40 % acetylinnholdet etter en reaksjonstid på en time.
For å studere evnen til deacetylering direkte, ble det utført et NMR-spektroskopi forsøk. Spektret viste at lyasen hadde god aktivitet, idet polymeren ble nedbrutt til gjennomsnittlig blokk-lengdeDPn ≈ 12, sammenlignet med utgangsmaterialet som har en gjennomsnittelig DPn ≈ 1500-2000.NMR-spekter viste også at acetylinnholdet var nesten likt før og etterbehandling med enzymetsom utgjør ca. 44-45 %. Dermed bekrefter NMR-resultatene at deacetylase ikke var aktiv.
Biofilmassay viste at bakterieveksten i biofilm etter 8 timer inkubering var hemmet ved høykonsentrasjoner av tobramycin, og vekstkurver for enzymet og kontrollen ser ganske like ut. | nb_NO |
