Novel alginate matrix for tissue engineering: selective substitution ofmannuronic acid residues in alginate with bioactive peptides and the use of these polymers as scaffolds for cells

Abstract

Alginate is a naturally occurring biopolymer that forms gels in the presence of divalent ions.It is a polysaccharide which functions as a structural component in marine brown algae and some bacteria. Alginate forms hydrogels by ionic cross-linking at very mild (physiological) conditions allowing immobilization in alginate to be carried out at cell suitable conditions.By entrapping therapeutic cells in alginate gels they can be protected from the host immune system upon transplantation, rendering the alginate gels useful in the treatment of diseases.Combinations of alginate materials and cells are also very attractive within tissue engineering and regenerative medicine.

Alginate can be tailored with the use of carbodiimide chemistry to graft functional peptidesto the polymer. The composition of the alginate can be further transformed by theC-5 epimerases which modify the structure of alginate, converting M-residues to G-residuesin the polymer in specific patterns, depending on the enzyme used. Studies have shownthat grafting functional peptides to biomaterials enhances cell-material interaction and theeffect is a cellular response. Hence the biomaterial can be tailored according to the desired response, making alginate a potential scaffold for tissue engineering.

In this study two different peptides were grafted to a mannuronan, GRGDSP (RGD) to batch1 and 2 and KHIFSDDSSE (neuropeptide) to batch 3., resulting in <0.2%, 0.1% and <0.1% peptide grafted to alginate in batch 1, 2 and 3 respectively. These alginates were further epimerised by AlgE4 and AlgE6 to prepare pairs of alginate samples with a polyalternating backbone interspaced with G-blocks (high G 70% and low G 50%). Characterization of composition and grafting was done by NMR. The alginates were purified by active coalfiltration and used to study the effect of RGD-grafted alginates, of different G-contents, in 2D and 3D cultures with C2C12 myoblasts and olfactory ensheathing cells (OECs). Furthermore, the study examined the effect of neuropeptide-grafted alginates in 2D and 3D cultures of OECs. The effect of gel rigidity on cell adhesion and viability was also reviewed. The metabolic activity of the cells was measured by a quantitative MTT assay and the morphology and viability of the cells studied with a live/dead assay by confocal microscopy.

When studying 2D cultures of C2C12 myoblasts it was observed that the cells attached to and stayed viable for at least 72 hours on the surface of RGD grafted alginate gels while they did not attach to non-peptide controls. OECs in 2D cultures showed the same behavior of attachment to the RGD alginate surfaces, albeit with altered morphological phenotype,while no attachment was observed with the control alginates. Contrary to the above, the 2D culture of OECs on neuropeptide coupled alginate (< 0.1% peptide) did not exhibit cells attaching to the surface. These results indicate that the RGD motif enhances cell adhesion for the cell types used in this study, nominating RGD grafted alginate as a credible matrix for tissue engineering.

3D culture of C2C12 myoblasts in RGD grafted alginates unveiled that the rigidity of the gel had a more profound effect on cell viability than peptide/no peptide in the alginate material.The cells were viable and the cell number relatively stable over the duration of the study of 41 days. The encapsulated cells showed the need to adjust to the new environment in the capsules, as a decrease in cells was seen at days 6-14 before the cell number increased again arround day 20 post encapsulation.

Encapsulated OECs in RGD alginate showed no clear preference for low G, high G or peptidegrafted capsules, only a prolonged period (1-6 days) of viability in the non-peptide alginates(one high G and one low G) compared to the peptide alginates and the UPLVG control. At16 days post encapsulation approximately 90% of the cells were dead in all capsules.

Neuropeptide-grafted alginate was also used to encapsulate OECs. Here, as with the OECs encapsulated in RGD alginate the cells showed no clear preference for low G, high G or peptide grafted capsules and the cells died over time in the neuropeptide-alginate capsules.

The 2D cultures in this study showed promising results towards the use of tailored alginates as scaffolds for tissue engineering. One application of these matrices could be controlled release of neurotrophic factors secreted by OECs in experimental models of central nervous system injury. Myoblasts could potentially be induced to differentiate into both muscle and bone cells for tissue engineering purposes.

Alginat er en naturlig forekommende biopolymer som danner geler ved tilstedeværelse avdivalente ioner. Alginat er et polysakkarid som fungerer som en strukturell komponent imarine brunalger og noen bakterier. Da alginat danner hydrogeler via ionisk kryss-binding ved svært milde (fysiologiske) betingelser, er immobilisering i alginat godt tilpasset celler.Innkapsling av terapeutiske celler i alginat er en strategi for å unngå kroppens immunforvar&nbsp; ved transplantasjon. Innkapslede celler kan benyttes ved behandling av sykdom og kombinasjonerav alginatmateriale og celler er svært attraktivt innen regenerativ medisin.

Alginatets egenskaper avhenger av dets sammensetning. Denne sammensetningen kan modifiseres ved å feste funksjonelle peptider til polymeren ved hjelp av carbodimiide kjemi.Sammensetningen av alginatet kan videre modifiseres ved hjelp av C-5 epimeraser, ensymersom omgjør M-enhter til G-enheter i polymeren i et spesifikt mønster, avhengig av hvilket enzym som benyttes. Tidligere studier har vist at å koble funksjonelle peptider til biomaterialer som alginat øker interaksjonen mellom celler og materiale og resulterer i en cellulærrespons. Biomaterialet kan dermed skreddersys for å oppnå en ønsket respons og er blir svært aktuelt som en plattform for vevs regenerering (tissue engineering).

I dette arbeidet ble peptidsekvensene GRGDSP (RGD) og KHIFSDDSSE (neuropeptid)koblet til ulike partier mannuronan. Resultatet ble tre partier med følgende prosent av peptid koblet til mannuronanet: <0.2%, ˜0.1% og <0.1%. Disse partiene med alginat blevidere epimerisert av enzymene AlgE4 og AlgE6 for å danne par av alginater med en polyalternerenderyggrad med innslag av G-blokker (høy G ˜70% og lav G ˜50%). Karakterisering av alginatenes komposisjon og koblingsgrad ble utført ved NMR-spektroskopi. Alginatprøvene ble renset ved filtrering gjennom aktivt kull og benyttet til å studere effekten avRGD-koblet alginat in 2D og 3D kulturer med C2C12 myoblaster og olfactory ensheathingceller (OECer). Dette arbeidet så også nærmere på effekten av neuropeptid-koblet alginat i2D og 3D kulturer med OECer. Til slutt ble effekten av gelelastisitet på de ulike celletypene vurdert. Den metabolske aktiviteten i cellene ble målt ved hjelp av et MTT assay og viabiliteten til cellene studert ved hjelp av en live/dead konfokal protokoll.

Under studiene av C2C12 myoblaster i 2D kulturer på RGD koblet alginat ble det observert at cellene festet seg og holdt seg i live over 72 timer på overflaten av disse gelene. Cellene festet seg ikke til noen av kontrollalginatene. OECer i 2D kulturer viste liknende oppførsel og festet seg til overflaten av RGD-koblet alginat, dog med endret fenotype, men ikke til kontrollalginatene. I motsetning til det som ble observert på RGD alginatene, så festet ikke OECene seg til overflaten av neuropeptid-koblet alginat (<0.1% peptid på alginatet). Disse resultatene viser at RDG sekvensen bidrar til at de undersøkte celletypene i dette arbeidet fester seg på alginatoverflaten. Ut fra dette kan man trekke frem RGD-koblet alginat som et godt egnet materiale til bruk i tissue engineering.

3D kulturer av C2C12 celler i RGD-koblet alginat viste at stivheten av gelen spiller en større rolle i påvirkningen av cellenes viabilitet enn selve peptidet på alginatoverflaten. Cellene viste også tegn til å trenge tid til å tilpasse seg det nye miljøet inni kapselen da en nedgang i metabolsk aktivitet ble observert 6-14 dager etter innkapsling før den økte igjen ved dag 20 etter innkaspsling.

OECer innkapslet i RGD alginat viste ingen preferanse for hverken lav G, høy G eller peptidkobletalginat. De overlevde noe lengre (1-6 dager) i kapslene av ikke-peptid-koblet alginatenn i de andre kapslene (RGD HG/LG I og UPLVG). Så mye som 90% av cellene i alle kapseltyper var døde 16 dager etter innkapsling.

Neuropeptid-koblet alginat ble også benyttet til innkapsling av OECer. Her, som ved innkapsling av OECer i RGD-koblet alginat viste cellene ingen preferanse for noen av kapseltypene og meste parten av cellene døde innen dag 14 etter innkapsling.

2D kulturene i dette studiet ciste lovende resultater for bruk av skreddersydd alginat sommaterial i vevs regenrering (tissue engineering). Et bruksområde for er slikt materiale kan være kontrolleert frigjøring av neurotrofiske factorer skilt ut av OECer i eksperimentelle modeller av sentralnervesystem skader. Myoblaster på sin side kan induseres til å differesiere til både muskel og bein celler for regenererings formål.