Alginat - protein interaksjoner

Abstract

Lite er kjent i forhold til proteiners interaksjon med alginat, noe som er viktig å ha kjennskap til ved bruk av biopolymeren som immobiliseringsmateriale for celler og proteiner. Denne oppgaven er derfor en studie av alginat protein interaksjoner. En interaksjon med albumin, fibrinogen og insulin ble undersøkt, da proteinene har relevans i forhold til release systemer av proteiner, og en immunrespons mot alginatkuler ved celletransplantasjon. Lysozym ble brukt som positiv kontroll, ettersom proteinet er kjent å interagere med alginat.Ettersom alginat er negative ladet er det naturlig å tro at elektrostatiske krefter har betydning for polymerens vekselvirkning med andre molekyler. For å undersøke elektrostatiske krefters innflytelse på alginat protein interaksjoner, ble proteinenes elektrostatiske overflatepotensial modellert ved hjelp av Adopter Poisson-Boltzmann Solver (APBS). Isoterm titreringskalorimetri (ITC) ble videre brukt for å måle vekselvirkningsvarmen ved interaksjon mellom proteiner og alginat i løsning. Proteinbinding til alginatkuler ble kvantifisert ved konsentrasjonsmålinger på nanodrop og mikroplateleser, og visualisert i mikroskop. Det ble tatt utgangspunkt i fysiologiske betingelser (pH = 7 og ionestyrke = 160mM), slik at forholdene samsvarte med det alginatkuler opplever ved transplantasjon.Ved ITC interagerte proteinene med alginat etter synkende styrke: lysozym (positivt ladet) >> albumin (negativt ladet) > fibrinogen (negativt ladet). Albumin og fibrinogen viste å interagere svakt med alginat, til tross for deres negative ladning. Dette kan forklares ved at proteinene har en stor overflate, med enkelte positive regioner selv ved pH > pI. Den høye ionestyrken brukt i studiet bidrar til å redusere de tiltrekkende kreftene mellom molekylene. Ingen målbar interaksjon ble observert mellom alginat og insulin (negativt ladet), noe som kan forklares ved at proteinet har en liten overflate med få positive regioner. Proteinbinding til alginatkuler viste samme trend som ITC, noe som indikerer at alginatets elektrostatiske egenskaper i gel og løsning er den samme. Binding av lysozym ga kulekollaps ved høye proteinkonsentrasjoner på grunn av kondensering til gelnettverket i alginat. Den svake bindingen av albumin og fibrinogen påvirket ikke kulenes stabilitet.Studiet indikerer at elektrostatiske tiltrekkende krefter har betydning ved alginat protein interaksjoner, og at proteinenes overflateladning har betydning for deres interaksjon med alginat. APBS viste å gi et bra bilde på proteinenes mulige interaksjon med alginat, ettersom det var bra korrelasjon mellom antatt og observert interaksjon. Dette kan forklares ved at APBS implementerer eksperimentelle forhold (pH, ionestyrke etc.) som har betydning for proteinenes elektrostatiske overflatepotensial. De eksperimentelle metodene brukt i studiet ga i flere tilfeller bare et kvalitativt mål på proteinenes interaksjon med alginat. Dette skyldes mest sannsynlig den svake (nanodrop og plateleser) og uspesifikke (ITC) interaksjonen som ble observerte.I videre arbeid vil det være interessant å se nærmere på adsorpsjon og absorpsjon av proteiner til alginatkuler eksponert for helblod, et modellsystem som samsvarer mer med det alginatkuler opplever ved transplantasjon. Hvordan proteinsammensetningen på kuleoverflaten endres over tid er også av interesse, ettersom proteinbinding ikke er en statisk prosess.