Utvikling og optimalisering av protokoll for massespektrometrisk metabolsk profilering av adherente humane celler

Abstract

I metabolomikk er målet å kvantifisere alle metabolitter i et biologisk system i en definert tilstand, på et bestemt tidspunkt. For å oppnå dette er en god protokoll for prøveopparbeidelse og analyse essensielt. Flere kritiske trinn (vasketrinn før metabolittekstraksjon, metabolittekstraksjon, oppkonsentrering av metabolittekstrakt og metode for normalisering av ulikt celleantall) i opparbeidelsen av metabolittekstrakt fra humane adherente celler har blitt evaluert og en protokoll for metabolsk profilering av det intracelleulære metabolomet i humane adherente celler har blitt utarbeidet.Flere vaskeløsninger ved ulik temperatur har blitt evaluert, og to vasketrinn med kald (0°C) fosfatbufret saltvann (PBS) før metabolittekstraksjon, ble ansett som den mest egnede vaskeløsningen. Et vasketrinn med vann etter PBS-vask førte derimot til et signifikant metabolittap.To ekstraksjonsmidler ble sammenlignet, og ekstraksjon med kokende etanol ble ansett som det mest effektive ekstraksjonsmiddelet i metabolittekstraksjon fra humane adherente celler. Etanolekstraktene innehold en signifikant høyere gjennomsnittlig metabolittkonsentrasjon av MCF-derivatiserte metabolittener, enn metanolekstraktene, samt at antallet uidentifiserte metabolitter klart var større i etanolekstraktene enn i metanolekstraktene. I tillegg førte ekstraksjon med kokende etanol til svært effektiv ekstraksjon av lipider.Væske-væske ekstraksjon med kloroform førte til et signifikant tap av metabolitter og ble derfor ikke ansett som en egnet metode for å fjerne lipidfraksjonen i metabolittekstraktene. Væske-væske ekstraksjon med heksan førte ikke til en betydelig fjerning av lipidfraksjonen i metabolittekstraktet og ble derfor ikke ansett som en egnet metode. Videre arbeid vil derfor være nødvendig, og solid-fase ekstraksjon av anses som en lovende kandidat for videre arbeid.«SpeedVaccing» av metabolittekstrakter ekstrahert med 75 % vandig etanol medførte langvarig inndamping ved hevet temperatur, noe som økte sjansen for tap av varmelabile metabolitter. Under frysetørking ble metabolittekstraktet holdt nedkjølt under hele prosessen og denne metoden ble derfor ansett som en mer egnet metode for oppkonsentrering av vannholdige metabolittekstrakter.Da adherente celler ikke kan telles før metabolittekstraksjon ble ulike normaliseringsmetoder undersøkt, blant disse var BCA proteinassay klart den mest egnede metoden og bruk av BCA mikroassay anbefales.Den optimaliserte protokollen ble brukt til å undersøke effekten av eksponering med 5 µM 5-Fluoruracil i 5 minutter, 2 timer og 8 timer på HeLa S3 celler. Den metabolske profilen til de eksponerte cellene viste en ganske liten endring i konsentrasjon av aminosyrer og organiske syrer.