Verdien av miRNA som biomarkør for kreft i prostata: Optimalisering av metode for RNA-isolering av formalinfiksert parafininnstøpt vev, samt undersøkelse av miRNA-uttrykk i ulik grad av prostatakreft

Abstract

Prostatakreft er den kreftformen som hyppigst rammer norske menn og dødelighet på grunn av avansert kreft i prostata er et klinisk problem. For å forstå molekylære ulikheter som skiller progressiv sykdom fra ikke-progressiv sykdom, vil identifisering av nye biomarkører som kan bidra til å gi en mer korrekt prognose være med på å forenkle behandling av pasienter med prostatakreft, og det er svært ønskelig med bedre behandlingsmetoder enn det som finnes i dag.miRNA er viktig under regulering av genuttrykk og det har vist seg at miRNA har en betydelig rolle under utvikling av kreft. Så langt er det bare et lite antall studier som har undersøkt uttrykk av miRNA relatert til prostatakreft. Målet med denne oppgaven var å utarbeide en optimal metode for isolering av total-RNA fra formalinfiksert parafininnstøpt vevsmateriale til bruk i undersøkelse av miRNA i vev fra prostata. Videre ville det være interessant å undersøke hvilken miRNA-profil som uttrykkes i Gleason grad 3, 4 og 5 for å finne ut om det er forskjell i miRNA-profil knyttet til alvorlighetsgrad av prostatakreft.Det ble tatt utgangspunkt i metode for isolering av total-RNA med RecoverAllTM Nucleic Isolation Acid Kit for formalinfiksert parafininnstøpt materiale, for å bedre utbytte total-RNA i vevsprøver fra prostata. Utprøving av ulike parametere som temperatur, inkubasjonstid med enzym, oppkutting av vevssylinder og homogenisering av vevssylinder ble gjennomført for å undersøke hvorvidt endringer kunne bidra til et bedre utbytte av RNA fra vevsmateriale som er formalinfiksert. Resultatene viser at optimal metode for isolering av RNA krever inkubasjon med enzymbehandling over natt (18 timer) for å få best utbytte RNA og høyest RIN-score. Ved isolering av RNA til analyse av miRNA er det tilstrekkelig med 3 timers inkubasjon med enzymbehandling, da mengde av kvantitert miRNA ser ut til å påvirkes i liten grad av inkubasjonstid over 3 timer. Mengde kvantitert miRNA i formalinfiksert materiale og ferskt materiale er tilnærmet likt, som betyr at formalinfiksert vevsmateriale kan benyttes på lik linje som ferskt materiale med hensyn på undersøkelse av miRNA.Det kommer tydelig frem av resultatene at det er gjennomgående lave konsentrasjoner RNA til stede i vevsmaterialet, og det er tydelig at RNAet er svært degradert, noe som gjenspeiles i den generelt lave RIN-scoren. Til tross for dårlig kvalitet på isolert RNA ble det laget cDNA-bibliotek til bruk i sekvensering av miRNA i formalinfiksert vevsmateriale. cDNA-bibliotekene viste mye adapterdimer som er forstyrrende for sekvensering av miRNA, og på bakgrunn av den dårlige kvaliteten på RNAet og forstyrrende DNA-sekvenser i prøvene, var det ikke mulig å gjennomføre sekvensering.