| dc.description.abstract | Målet for denne masteroppgaven var å utvikle en metode for immobilisering av S. cerevisiae til en glassoverflate samt å undersøke hvordan celleveggens elastisitet til S. cerevisiae blir påvirket av kitosan med 66% eller 94,4% deacetylering. Undersøkelsene har bestått av måling av zetapotensial, bestemmelse av Youngs modulus ved nanoindentering med AFM og bruk av kvantitativ fasekontrastmikroskopi for å observere morfologiske endringer samt at fasekontrastmikroskopi ble benyttet for inspeksjon av immobiliseringsforsøkene. Måling av optisk tetthet ble benyttet for bekreftelse av stabil fase til gjærcellene under forsøkene. I tillegg ble bovint serumalbumin (BSA) ble forsøkt benyttet for å hindre immobilisering av S. cerevisiae til glassoverflater.
Masteroppgaven er bygget opp med en introduksjonsdel der det blir gitt en oversikt over relevant informasjon fra litteraturen om Saccharomyces cerevisiae og den kationiske polymeren kitosan som danner grunnlaget for oppgaven. Videre presenteres aktuell forskning for problemstillingen om påvirkninger av celleveggens elastisitet og metoder for immobilisering med utfyllende informasjon om poly-L-lysin som blir benyttet i oppgaven. Teori for bestemmelse av optisk tetthet, lysmikroskopi, bestemmelse av zetapotensial og AFM blir deretter presentert. Etter dette følger presentasjon tilknyttet det praktiske arbeidet utført. Materialer og eksperimentelle metoder blir presentert fulgt av resultater, diskusjon av resultatene og konklusjon. Til slutt blir forslag for videre studier bygget på funnene fra arbeidet med masteroppgaven presentert.
Bestemmelse av zetapotensialet til S. cerevisiae ble brukt som et verktøy for metodeutviklingen for immobilisering av gjærceller på glassoverflater samt for å undersøke interaksjonen mellom kitosan og gjærens cellevegg. Det ble funnet at egenskapene til løsningen som gjærcellene var suspendert i var viktig for gjærcellens muligheter for å danne forbindelser ved elektrostatisk interaksjon med en funksjonalisert glassoverflate. Det negative zetapotensialet til S. cerevisiae ble mer skjermet i gjærekstrakt peptone dekstrose (YPD) media. Det ble også funnet at ved bestemmelse av zetapotensial er det viktig å behandle prøvene likt, da det ble funnet indikasjoner på at zetapotensialet økte over tid og varierte avhengig av konsentrasjonen av gjærceller i prøvene. Isoelektrisk punkt (IEP) til S. cerevisiae ble funnet til å ligge mellom pH 3 og 4. Ved tilsats av kitosan til suspensjoner av gjærceller i buffer eller Milli-Q(MQ)-vann ble det observert en signifikant økning i zetapotensialet fra en negativ til en positiv verdi. Dette indikerer at kitosan legger seg rundt gjærcellen. 94,4% deacetylert kitosan viste en høyere økning i zetapotensialet enn 66% deacetylert kitosan ved pH 6,5. Det ble derimot observert en signifikant nedgang i zetapotensialet til gjærcellene eksponert for kitosan i YPD-media der årsaken ble antatt å være utfelling av komplekser av kitosan og partikler i YPD-media.
Immobilisering av S. cerevisiae ble oppnådd ved funksjonalisering av glassoverflaten med α-poly-L-lysin (PLL) etterfulgt av tørking, før en konsentrert suspensjon av S. cerevisiae i enten HEPES- eller MOPS-buffer ble påført glassoverflaten. Etter 10 minutter ble overflaten skylt forsiktig slik at det ble dannet et lag med celler på glassoverflaten. Denne immobiliseringsmetoden førte til et tett dekke av gjærceller på glassoverflaten som viste lite mobilitet og dermed kunne benyttes for nanoindentering med AFM. Videre undersøkelser indikerte at funksjonalisering av glassoverflate med PLL som hadde lav (15 000 Da) og høy (300 000 Da) molekylvekt samt økt at ionestyrke på løsningen ved funksjonaliseringen ga høyere mobilitet til gjærcellene. Funksjonalisering av glassoverflater med BSA hindret immobilisering, men viste en større grad av gjenværende celler enn ved bruk av en ufunksjonalisert glassoverflate.
Ved hjelp av nanoindentering med AFM ble celleveggens elastisitet bestemt. Hertz-Sneddon-modellen ble benyttet for beregning av Youngs modulus fra kraft mot avstandskurvene oppnådd ved nanoindentering av gjærcellens overflate. En rekke feilkilder ble funnet ved bestemmelse av Youngs modulus til gjærcellenes cellevegg. Resultatene kunne allikevel gi indikasjon på en økning i celleveggens elastisitet ved eksponering for 66% deacetylert kitosan der gjennomsnittsverdien av Youngs modulus var 72±58 kPa og 46±42 kPa for henholdsvis ueksponerte og eksponerte gjærceller. Det ikke kan derimot ikke trekkes noen konklusjoner om virkningen av 94,4% deacetylert kitosan på celleveggens elastisitet siden det ikke ble oppnådd tilstrekkelig mengde eksperimentelle data. Kvantitativ fasekontrast ytterligere indikasjon på en økning i elastisiteten da gjærcellers eksponering for begge kitosaner førte til en observerbar reduksjon av høyden til gjærcellene. | |
