Development of Sample Preparation Techniques for Analysis of Environmental Toxins in Fish Tissue by GCxGC-HRMS

Abstract

Effektiv miljøovervåkning av marine arter avhenger av effektive prøveopparbeidings-metoder for å håndtere kompleksiteten i vevsmatriser og observere spredningen av giftstoffer. Denne oppgaven utforsker ulike teknikker for opparbeiding av fiskevev, med særlig fokus på viktige trinn som homogenisering, ekstraksjon og opprensing. Etter en grundig litteraturgjennomgang ble en modifisert Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS) metode og løsemiddelekstraksjon kombinert med gel permeasjonskromatografi (GPC) eller NH2-opprensing valgt til utprøving. Samarbeidet med SINTEF Ocean innenfor prosjektrammene til ToxiGen og AQUAvit har gjort denne oppgaven mulig.

Arbeidet ga økt innsikt i optimalisering av homogenisering, hvor tilsats av løsnings-midlene diklorometan:n-heksan eller acetonitril før, samt salt som NaCl og Na2SO4 etter homogenisering, viste seg å være mest effektivt. Acetonitril var særlig egnet til vevsnedbrytning. Metodene for ekstraksjon varierte; QuEChERS-metoden bestod av kun ett trinn, og DCM:Hex løsemiddelekstraksjonen bestod av tre trinn med bruk av ultralydbad. For en sammenlikning, må mengden analytter ekstrahert ved brukt av de ulike metodene ses i sammenheng med de påfølgende opprensningstrinnene.

Opprensningsmetodene spilte en viktig rolle i fjerningen av forstyrrende biologiske forbindelser. Ved separasjon av ekstraktet, viste NH2-fraksjonering seg egnet for organer fra polar torsk ved å effektivt fjerne lipider samtidig som den bevarte ikke-polare analytter. For muskelvev fra laks var valget mellom GPC og QuEChERS avhengig av flere faktorer, inkludert tidsforbruk og kostnadseffektivitet. GPC utmerket seg i analyttdeteksjon, mens QuEChERS viste seg å være effektiv og økonomisk.

Endringer i opprensningsmetoden til QuEChERS, hvor mengden Z-Sep sorbent ble justert fra 50 mg til 200 mg, resulterte i en betydelig reduksjon av biologiske komponenter som kolesterol (-49,1 %), 2-oleoyl glyserol (-99,0 %), niacinamid (-80,9 %) og C18 umettede fettsyrer (-88,9 %), til tross for en økning i forurensning på 93,6 %. Kromatografisk analyse avdekket forskjeller i metodene: GPC viste en høyere andel lipider, mens QuEChERS hadde lavere intensitet på toppene og færre identifiserte forbindelser, noe som indikerer unike egenskaper med hensyn til effektivitet.

Efficient environmental monitoring of marine species hinges on careful sample preparation methods to navigate the complexities of tissue matrices and observe toxin spread. This study test out diverse techniques for preparing fish tissues, focusing on homogenization, extraction, and clean-up. Through a comprehensive literature review, a modified Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS) method and solvent extraction coupled with gel permeation chromatography (GPC) or NH2 clean-up were selected for experimentation. Collaboration with SINTEF Ocean within the framework of the ToxiGen and AQUAvit projects facilitated this research.

The investigation unveiled critical insights into optimizing homogenization, where addition of solvents (dichloromethane:n-Hexane and acetonitrile) before and salt (NaCl and Na2SO4) after homogenization proved most efficient, with acetonitrile demonstrating superior tissue breakdown capabilities. Extraction methodologies diverged; the QuEChERS method involved a single step, whereas GPC solvent extraction necessitated three steps employing ultrasonication. The importance of the amount of analytes extracted using these methods needed to be considered along with the following clean-up step.

Clean-up procedures played an important role in eliminating interfering biotic compounds. Differentiating between sample tissues, NH2-fractionation turned out as suitable for polar cod organ tissues, by excelling at lipid removal while preserving nonpolar target compounds. For salmon muscle tissue, the selection between GPC and QuEChERS was dependent upon several factors including time consumption and cost-effectiveness. QuEChERS demonstrated efficiency and profitability, while GPC excelled in analyte detection.

Noteworthy adjustments in the QuEChERS clean-up method, particularly the amount of the sorbent Z-Sep from 50 mg to 200 mg, resulted in significant reductions in biological compounds such as cholesterol (-49.1 %), 2-oleoyl glycerol (-99.0 %), niacinamide (-80.9 %), and C18 unsaturated fatty acids (-88.9 %), although with an increase in contamination by 93.6 %. Chromatographic analysis outlined method differences; GPC exhibited residual lipids, while QuEChERS presented lower peak intensity and fewer identified compounds, suggesting unique characteristics in effectiveness.