Improving the Dynamic Sensing Range of Electrochemical Enzymatic Lactate Biosensors for Sweat Monitoring Applications

Abstract

Svette er en lett tilgjengelig kroppsvæske for ikke-invasiv og kontinuerlig sanntidsmåling av laktat under fysisk aktivitet. Elektrokjemiske enzym-baserte biosensorer er lovende for integrering i en bærbar sensorenhet, da de gir rask, nøyaktig og sensitiv laktatmåling. Et stort hinder for realiseringen av en svettelaktatsensor er det begrensede deteksjonsområdet til biosensoren sammenliknet med fysiologisk relevante laktatkonsentrasjoner. Det overordnede målet med denne oppgaven er å identifisere hvilke faktorer som begrenser deteksjonsområdet til laktatbiosensorene og å undersøke mulige endringer i sensorformuleringen som kan øke den øvre deteksjonsgrensen.

Amperometriske laktatbiosensorer ble laget ved å funksjonalisere arbeidselektroden på trykte elektrodesubstrater med en Prussian Blue tynnfilm, et enzymlag bestående av laktat oksidase og enkeltvegget karbonnanorør immobilisert i en matriks av chitosan og en ytre Nafionmembran. Elektrodeponering ble brukt til å legge på Prussian Blue-filmen, mens både enzym- og membranlagene ble påført manuelt ved å legge dem dråpevis på arbeidselektroden. Biosensorene ble testet kronoamperometrisk i fosfatbuffer, med en gradvis økning av laktatkonsentrasjon i løsningen frem til signalet ble mettet. Syklisk voltammetri ble brukt til å vurdere stabiliteten til Prussian Blue.

De eksperimentelle funnene indikerte at det maksimale strømsignalet fra sensorene var begrenset av mengden oppløst oksygen i testløsningen. Ved å teste en sensor i en oksygen-beriket løsning ble strømsignalet 104% høyere enn når den samme sensoren ble testet under standard forhold. Det maksimale strømsignalet ble ikke forbedret ved å øke kapasiteten til enzymlaget, hvilket underbygget hypotesen om at signalet var begrenset av oksygentilgang og ikke av lav enzymaktivitet. For å likevel kunne øke den øvre deteksjonsgrensen så ble egenskapene til sensormembranen modifisert med formålet om å redusere fluksen av laktat gjennom membranen. Å bruke sulfofenylert-polyfenylen med bifenyl-linker som membran istedenfor Nafion viste ingen forbedring. Derimot, inkorporering av cerium i Nafion-membranene hadde en kryss-linkende effekt, og en økning i deteksjonsområdet fra 8 mM til 10 mM ble demonstrert av en sensor med cerium-Nafion-membran. Denne sensorresponsen styrket hypotesen om at cerium kan brukes til å redusere permeabiliteten av laktat i membranen og dermed utvide deteksjonsområdet. Dataene var imidlertid begrenset til bare 3 sensorer grunnet mangelen på en praktisk og biosensor-kompatibel metode å inkorporere cerium i membranen på. Ettersom sensorene var lite reproduserbare så er det nødvendig med mer testdata for å kunne konkludere med en signifikant effekt. Ved å finne en egnet inkorporeringsmetode og optimal cerium-dose kan deteksjonsområdet muligens utvides ytterligere. For å kunne monitorere laktat i ufortynnet svette må deteksjonsområdet ytterligere økes med en faktor 10, da laktatkonsentrasjonen kan bli opp mot 100 mM.

Sweat is a readily available body fluid for non-invasive, continuous and real-time monitoring of lactate during athletic activity. Electrochemical enzymatic biosensors present a promising and viable option for rapid, accurate and sensitive sweat lactate wearable monitoring. A major hurdle to overcome for realising a sweat lactate biosensor is the limited detection range compared to physiologically relevant sweat lactate concentrations. The overall aim of this work was to identify the mechanisms limiting the maximum signal of the lactate biosensors employed in previous work and examine formulation adjustments increasing the upper lactate detection limit.

Amperometric lactate biosensors were assembled by modifying the working electrodes of screen-printed electrode substrates with a thin film of Prussian Blue, an enzymatic layer of lactate oxidase and single-walled carbon nanotubes immobilised in a chitosan matrix and an outer Nafion membrane. The Prussian Blue film was electrodeposited whereas the enzyme and membrane layers were manually drop cast onto the electrode. The biosensors were chronoamperometrically tested in a phosphate buffer with stepwise lactate concentration increments until reaching current signal saturation. Cyclic voltammetry was employed to evaluate the stability of Prussian Blue.

Experimental findings indicated that the maximum current signal was ultimately limited by availability of dissolved oxygen in the test solution. Testing sensors in oxygen-enriched solution enhanced the maximum current response by 104% compared to standard testing conditions. Efforts to enhance the activity of the enzyme layer did not increase the maximum current signal, further reinforcing that sensors were ultimately limited by oxygen availability and not by catalytic activity of the enzymatic layer. To increase the dynamic range, the sensor membranes were modified to reduce the lactate flux over the outer membrane. Employing membranes made from sulfophenylated-polyphenylene with biphenyl linker did not improve sensor performance compared to Nafion. Incorporating cerium into the Nafion membranes induced polymer cross-linking, and an extended detection limit from 8 mM to 10 mM lactate was demonstrated with a cerium-Nafion composite membrane sensor. The achieved sensor performance supports the feasibility of cerium to reduce membrane lactate permeability and increase the dynamic range, but test data was limited to only 3 sensors due to the lack of a convenient and biosensor-compatible method of cerium incorporation. Given the low sensor reproducibility, larger sample sizes are needed to conclude a significant effect of the cerium composite membranes. Identifying a suitable incorporation method and cerium loading could further increase the dynamic range. An additional 10-fold increase would be necessary for lactate monitoring in undiluted sweat, approaching concentrations of 100 mM.