Cytotoksiske effekter av tralopyril på morfologi og celleproliferasjon hos RTgill-W1 in vitro

Abstract

I denne bacheloroppgaven blir de cytotoksiske effektene av tralopyril på cellelinjen etablert fra regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) RTgill-W1 undersøkt, med fokus på metodevalidering. Bakgrunnen er en økt bruk av tralopyril som impregneringsstoff på nøter i oppdrettsnæringen, der det er sett et behov for kartlegging av mulige biologiske konsekvenser for marine organismer. Målet med studien var å undersøke effekten av tralopyril på celleproliferasjon og cellesyklus, samt metodevalidering av relevante analysemetoder (BrdU-inkorporering med analyse på flowcytometer, flowcytometrisk analyse etter farging med PI og MTT-assay). Studien ble gjennomført i tre hoveddeler: screeningforsøk, testforsøk og hovedforsøk. Innledningsvis ble et screeningforsøk utført for å kartlegge hvilke konsentrasjoner av tralopyril som hadde en effekt på morfologi og cellevekst i RTgill-W1 cellene. Cellene ble eksponert for ulike konsentrasjoner av tralopyril (1, 3, 10, 50 og 100 µM). Videre ble mikroskopiske observasjoner etter 24 og 40 timer utført. Resultatene viste at celleveksten ble påvirket selv ved lavere konsentrasjoner av tralopyril, og at de morfologiske endringene ble mer markante ved høyere konsentrasjoner og lengre eksponeringstid. Testforsøket ble utført for å optimalisere metodene som skulle benyttes i studien. Metodene som ble utforsket var BrdU-inkorporering med analyse på flowcytometer, flowcytometrisk analyse etter farging med PI og MTT-assay. Til tross for forsøk på optimalisering av BrdU-inkorporering med analyse på flowcytometer, indikerte resultatene utfordringer med metoden. På grunn av tidsmangel ble en optimalisering av denne metoden ikke mulig. Resultatet fra testforsøk med farging med PI og MTT-assay ga indikasjon på fungerende metoder, og ble derfor valgt for videre undersøkelser i hovedforsøk. I hovedforsøket ble det i farging med PI utført cellesyklusanalyser av fire konsentrasjoner av tralopyril (10, 30, 70 og 100 µM) med to paralleller hver. Resultatene viste liten endring i cellesyklus mellom konsentrasjonene, med en svak indikasjon på opphoping i S-fasen og nedgang i G0/G1-fasen. I MTT-assay ble et konsentrasjonsintervall mellom 1-100 µM med fire paralleller til hver konsentrasjon benyttet for å utforske celleproliferasjonen til RTgill-W1. Resultatet indikerte en endring i celleviabilitet allerede ved en konsentrasjon på 1 µM tralopyril. Celleviabiliteten synker ytterligere ved høyere konsentrasjoner av tralopyril. Den morfologiske undersøkelsen i studien indikerer at tralopyril har en cytotoksisk effekt på RTgill-W1 cellelinjen. Metodene som ble utforsket, flowcytometer PI og MTT-assay, er fungerende for RTgill-W1 celler, og kan benyttes i senere toksikologisk forskning. På grunn av mangel på tid og reagenser ble det ikke innhentet tilstrekkelig med verdier til å kunne lage statistisk gyldige framstillinger av resultatet, og det kan dermed ikke konkluderes i hvilken grad tralopyril har en effekt på RTgill-W1. Studien viser behov for mer detaljert forskning for å fullstendig kartlegge effekten av tralopyril på RTgill-W1.

This bachelor’s thesis investigates the cytotoxic effects of tralopyril on the RTgill-W1 cell line derived from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), with a focus on method validation. The background for the study is the increased use of tralopyril as an antifouling agent on fish farming nets, raising concerns about potential biological effects on marine organisms. The aim of the study was to assess the effect of tralopyril on cell proliferation and cell cycle, as well as to validate relevant analytical methods (BrdU incorporation analyzed by flow cytometry, flow cytometric analysis after PI staining, and the MTT-assay). The study was conducted in three main phases: a screening experiment, a test experiment, and the main experiment. Initially, a screening experiment was conducted to determine which concentrations of tralopyril affected cell morphology and growth in RTgill-W1 cells. The cells were exposed to various concentrations of tralopyril (1, 3, 10, 50 and 100 µM), followed by microscopic observations after 24 and 40 hours. The results showed that cell growth was affected even at lower concentrations of tralopyril, with more pronounced morphological changes observed at higher concentrations and longer exposure durations. The test experiment aimed to optimize the methods used in the study. The methods explored included BrdU incorporation with flow cytometric analysis, flow cytometric analysis after PI staining, and the MTT-assay. Despite attempts at optimizing the BrdU method, results indicated challenges with its implementation, and due to time constraints, further optimization was not possible. The results from PI staining and the MTT-assay proved functional and were therefore selected for further investigation in the main experiment. In the main experiment, cell cycle analyses were conducted using PI staining at four tralopyril concentrations (10, 30, 70 and 100 µM), with two replicates for each. The results showed little variation in cell cycle distribution between the concentrations, with slight indication of accumulation in the S phase and a decrease in the G0/G1 phase. The MTT-assay was conducted using a concentration range of 1-100 µM, with four replicates per concentration, to assess RTgill-W1 cell proliferation. The results indicated a reduction in cell viability at concentrations as low as 1 µM, with further declines observed at higher concentrations. Morphological assessments in the study suggest that tralopyril exerts a cytotoxic effect on the RTgill-W1 cell line. The methods explored, PI staining for flow cytometry and the MTT assay, proved suitable for use with RTgill-W1 cells and may be applicable in future toxicological research. Due to limited time and reagents, there were insufficient data to produce statistically valid representations of the results, and it is therefore not possible to conclude the exact extent of tralopyril’s impact on RTgill-W1. The study highlights the need for further detailed research to fully elucidate the effects of tralopyril on RTgill-W1 cells.