Investigating protein secretion into cerebrospinal fluid: A study of the choroid plexus secretome

Abstract

Choroid plexus (ChP) er vesentlig for produksjon og regulering av cerebrospinalvæsken (CSV). Selv om CSV tradisjonelt har blitt sett på som en passiv væske, har nyere studier vist at den deltar aktivt i nevromodulering, hjerneutvikling og fysiologisk signalisering. Derimot er den molekylære identiteten til proteinene som skilles ut fra ChP, og væskens proteom, dårlig karakterisert. Denne studien hadde som mål å visualisere og karakterisere proteiner som skilles ut i CSV hos sebrafisk ved hjelp av metabolskmerking, proksimal proteinmerking og målrettet uttrykk av sekretoriske proteiner. Metabolskmerking ble utført ved bruk av FUNCAT (fluorescerende merking av ikke-kanoniske aminosyrer) og BONCAT (bio-orthogonal merking av ikke-kanoniske aminosyrer). Begge metodene ble utført ved å utrykke en modifisert metionyl-tRNA syntetase (MetRS*) for inkorporering av den ikke-kanoniske aminosyren azidonorleucin i proteiner, som deretter merkes gjennom klikk-kjemi. I tillegg ble en alternativ metode for proteomisk merking undersøkt ved bruk av det forbedrede askorbatperoksidase-systemet (iAPEX), som muliggjør lokal merking av proteiner under betingelser med hydrogenperoksid (H₂O₂). For å produsere H₂O₂ lokalt ble enzymet D-amino acid oxidase co-uttrykt med APEX2. Til slutt, for å undersøke sekresjonsmønstrene til ulike typer proteiner, ble det humane nevropeptidet Y (hNPY) og det sekretoriske proteinet starmaker-GFP (STM-GFP) overuttrykt i nevroner. hNPY ble i tillegg uttrykt i ChP-celler for å sammenligne sekresjonen fra ulike cellulære opphav. FUNCAT viste merking av proteiner i MetRS*-uttrykkende celler, men klarte ikke å vise utskilte proteiner på grunn av høy uspesifikk merking. Tilsvarende viste BONCAT ingen detekterbare proteiner, trolig grunnet utilstrekkelig mengde prøver, noe som ble indikert av svake bånd i den BlueSafe-fargede SDS-PAGE-gelen. iAPEX ga heller ingen vellykket merking og viste høy uspesifikk biotinylering. I kontrast ble hNPY vellykket uttrykt og skilt ut fra både NPY-uttrykkende nevroner og fabp7b-positive ChP-celler. Sekresjon av STM-GFP uttrykt i nevroner ble derimot ikke detektert, sannsynligvis på grunn av lavt transgenuttrykk eller ulikt sekresjonsmønster sammenlignet med ChP-celler. Disse funnene fremhever de tekniske og biologiske utfordringene ved å studere CSV-proteomet in vivo. Videre optimalisering av merkingsmetoder og strategier for transgenuttrykk vil være avgjørende for å øke forståelsen av CSF-mediert signalering og dens rolle i hjerneutvikling og nevrologisk sykdom.

The choroid plexus (ChP) plays a key role in producing cerebrospinal fluid (CSF) and regulating its composition. While CSF has traditionally been viewed as a passive fluid, recent studies have revealed its active involvement in neuromodulation, brain development, and physiological signaling. However, the molecular identity of ChP-secreted proteins and the broader CSF proteome remain poorly characterized. This study aimed to visualize and characterize proteins secreted into the CSF of zebrafish using metabolic labeling, proximity labeling, and targeted expression of secreted proteins. Metabolic labeling was achieved using fluorescent non-canonical amino acid tagging (FUNCAT) and bio-orthogonal non-canonical amino acid tagging (BONCAT). Both methods relied on the expression of a modified methionyl-tRNA synthetase (MetRS*) to incorporate the non-canonical amino acid azidonorleucine into proteins, which are then tagged via click chemistry. Additionally, an alternative proteomic labeling method was explored using the improved ascorbate peroxidase (iAPEX) system, which facilitates localized protein labeling under hydrogen peroxide (H₂O₂) conditions. To generate H₂O₂ locally, the enzyme D-amino acid oxidase was co-expressed with the labeling enzyme APEX2. Lastly, to investigate the secretion patterns of different protein types, the human neuropeptide Y (hNPY) and the secreted protein starmaker fused to GFP (STM-GFP) were overexpressed in neurons. hNPY was additionally expressed in ChP cells to compare secretion from different cellular origins. FUNCAT showed labeling of proteins within the MetRS*-expressing cells but failed to detect secreted proteins due to high nonspecific labeling. Similarly, BONCAT showed no detectable proteins, likely due to insufficient sample volume, as indicated by the weak bands observed in the BlueSafe-stained SDS-PAGE. iAPEX also failed to provide labeling, showing high nonspecific biotinylation. In contrast, hNPY was successfully expressed and secreted from both NPY-expressing neurons and fabp7b-positive ChP cells. However, STM-GFP expressed in neurons was not detected in the CSF, likely due to low transgene expression or differing secretion dynamics compared to ChP cells. These findings highlight the technical and biological challenges of studying the in vivo CSF proteome. Further optimization of labeling techniques and transgene expression strategies will be crucial for advancing our understanding of CSF-mediated signaling and its role in brain development and neurological disease.