Development and Testing of Promoter Strength and Cassettes for Regulation of Replication with TrfA in Azotobacter chroococcum

Abstract

Denne studien er en del av et større prosjekt som har som mål å utvikle en verktøykasse for innsetting og fjerning av DNA, designet som et betinget selvmordsplasmid basert på RK2-plasmidet. Fordelen med et betinget selvmordsplasmid er at det kan kontrolleres utenfra til å forsvinne fra cellepopulasjonen etter at det har levert sine tjenester. For å oppnå et funksjonelt betinget selvmordsplasmid er det avgjørende å kunne kontrollere replikasjonsprosessen slik at den kan skrus av og på. Ideen bak denne kontrollen er å plassere et induserbart promotersystem oppstrøms for genet for replikasjonsinitiering, trfA, kodet av RK2-plasmidet.

Den temperatursensitive 247C-mutasjonen og en kombinasjon av 247C-mutasjonen og copy-up 171T-mutasjonen, endrer plasmidkopitallet i cellen og kan brukes til å regulere plasmidstabilitet. Flere mutasjoner av TrfA-proteinet er blitt brukt i denne studien, som hat som mål å utvikle og analysere forskjellige promotor- og trfA-kombinasjoner, samt evaluere ulike promoterer ved bruk av reportergen i Azotobacter chroococcum. Deretter er det mulig å velge et promotersystem som effektivt kan aktivere og deaktivere transkripsjonen av trfA etter behov, og bidra til den betingede delen av det betingede selvmordsplasmidet. Disse funnene kan bidra til optimalisering av genetisk modifisering og testing.

Basert på dyrkingseksperimentet som ble utført, ble PantA identifisert som det mest lovende promotersystemet til å kunne regulere replikasjonen av et betinget selvmordsplasmid i A. chroococcum. Promotersystemet viste lave nivåer av genuttrykk i fravær av inducer og når induser ble tilsatt, økte målingene med mer enn 100 ganger. mCherry ble brukt som reportergen for genuttrykk, og fluorescensen ble målt. Plasmidstabiliteten til pVW4-plasmidet, som inneholdt promotorsystemet Ptrc , viste seg å være svært ustabilt i kombinasjon med trfA. Både med og uten induser i flytende media, ble det identifisert null kolonier da bakteriekulturen ble strøket ut på RA1 + Kan. Parallelt ble åtte nye plasmider med forskjellige promotorsystemer og trfA-kombinasjoner konstruert for å analysere plasmidstabiliteten i A. chroococcum.

Andre resultater fra studien inkluderer anbefalinger om justering av induserkonsentrasjoner ved testing av plasmidstabilitet og promotorstyrke. Samtidig som egenskapene til promotersystemer og trfA-kombinasjoner i A. chroococcum ble studert, ble det oppdaget et rødt pigment når bakteriekulturer av A. chroococcum ble tilsatt m-tol. Dette skyldes sannsynligvis en stressrespons i cellene, enten på grunn av m-tol eller etanol.

This study is part of a larger project aimed at developing a toolbox for the insertion and deletion of DNA, designed as a conditional suicide plasmid based on a RK2 plasmid. The advantage of a conditional suicide plasmid is its ability to be modified to vanish from the cell population after it has delivered its services. To be fully functioning, it is essential to control the replication process, allowing the replication to be turned on and off. This level of control can be accomplished by inserting inducible promoters upstream of the RK2-encoded replication initiation gene, trfA.

Several mutations of the TrfA protein have been described, such as the ones encoding the temperature-sensitive 247C mutation, and a combination of the ts 247C mutation and the copy-up 171T mutation. These mutations alter the plasmid copy number and can be used to regulate plasmid stability in the cell. This study aims to develop and analyze different promoter system and trfA combinations, as well as evaluating different promoter systems using reporter genes in Azetobacter chroococcum. Thereby, it is possible to select a promoter system that is able to effectively activate and deactivate gene expression of trfA as needed, and attribute to the conditional part of the conditional suicide plasmid. These findings can attribute to optimization of genetic construction and testing.

Based on the cultivation experiment performed, the PantA system was identified as the most promising promoter system for regulating replication of a conditional suicide plasmid in A. chroococcum. It demonstrated low levels of gene expression in the absence of an inducer, and when inducer was added to the cell culture, the measurements increased by more than 100-fold. mCherry was used as reporter gene for gene expression, and the fluorescence was measured. When studying plasmid stability of plasmids with a combination of promoter systems and the trfA-gene, the pVW4 plasmid, containing the Ptrc promoter system happened to be very unstable, as zero colonies grew when plated on RA1 + Kan. In parallel, eight new plasmids with different promoter systems and trfA-gene combinations were constructed to be analyzed for plasmid stability.

Other results from the study included recommendations for adjusting inducer concen- trations when analyzing plasmid stability and promoter strength. Surprisingly, while studying the properties of promoter systems and trfA-gene combinations in A. chroococcum, the presence of m-toluic acid resulted in production of a red pigment. This is likely due to a stress response in the cells, to either m-toluic acid or ethanol.