Evaluation of cell viability, CYP1A activity and genotoxic effects following exposure to ternary mixtures of benzo(α)pyrene (B[α]P), 2,2',3,4,4',5'-hexachlorobiphenyl (PCB 138) and perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) in H4IIE rat hepatoma cells

Abstract

Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), polyklorerte bifenyler (PCB) og per- og polyfluorerte alkylstoffer (PFAS) er tre klasser av utbredte miljøgifter som kan forekomme sammen i komplekse blandinger. Disse kjemikaliene utgjør en betydelig risiko for både dyreliv og mennesker på grunn av deres persistens i miljøet og deres evne til å bioakkumulere og biomagnifisere gjennom næringskjeder. PAH er ikke definert som persistente, men på grunn av de høye miljøkonsentrasjonene, representerer de likevel en risiko for levende vesener. Alle disse forbindelsene kan forårsake en lang rekke effekter, inkludert oksidativt stress og DNA-skader. Benzo[a]pyren (B[a]P), et representativt PAH, er en velkjent induserer av CYP1A1-enzymet, som aktiverer det til en reaktiv metabolitt. PCB 138 og PFOS har derimot vist seg å redusere induksjon av CYP1A-enzymer. I denne studien ble tre representative forbindelser, B[a]P, PCB 138 og PFOS, undersøkt med tanke på potensialet for å redusere cellelevedyktigheten, indusere CYP1A1 og generere DNA-dobbeltrådbrudd (DSB) i rottehepatomcellelinjen H4IIE. Endepunktene ble evaluert etter 48 timers eksponering ved hjelp av henholdsvis 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse, etoksyresorufin-O-deetylase (EROD)-analyse og gelelektroforese. H4IIE-celler ble eksponert for 0,1, 0,505 og 1 µM B[a]P, PCB 138 og PFOS enkeltvis og i 17 ternære blandinger for både cellelevedyktighet- og CYP1A-induksjon. DNA DSB ble kun vurdert for blandinger. Blandingene ble designet med en sentral komposittdesign med sentrert overflate (CCF). Ingen av enkeltkjemikaliene så ut til å indusere CYP1A1-induksjon. Likevel viste blandinger med høye konsentrasjoner av B[a]P og lave konsentrasjoner av PCB 138 økt CYP1A1-katalytisk hastighet, etterfulgt av økt DNA-FTM, for én blanding som var signifikant høyere enn kontrollen. Når konsentrasjonen av PCB 138 økte i blandingen, gikk derimot CYP1A1 og DNA-FTM tilbake til kontrollnivå. Disse resultatene støtter hypotesen om at PCB 138 er en AhR-antagonist og begrenser dannelsen av den B[a]P-reaktive metabolitten. Ordinære minste kvadraters regresjonsanalyser (OLS) viste en negativ korrelasjon mellom interaksjonsleddet B[a]P:PCB 138:PFOS og DNA-FTM, noe som tyder på at kombinasjoner av de tre kjemikaliene i de testede konsentrasjonene ikke produserer reaktive oksygenforbindelser (ROS) i nivåer som ville indusere oksidativt stress og øke forekomst av DNA-skader. Denne studien understreker viktigheten av å ta hensyn til kjemiske interaksjoner, i ulike kombinasjoner, og understreker behovet for mer omfattende risikovurderinger som evaluerer effektene av kombinerte eksponeringer i stedet for enkeltkjemikalier alene.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) are three classes of widespread contaminants which can occur together in complex mixtures. These chemicals pose significant risks to both wildlife and humans due to their persistence in the environment and their ability to bioaccumulate and biomagnify through food chains. PAHs are not defined persistent, however, due to their high environmental concentrations they still represent a risk to living beings. All of these compounds can induce a wide range of effects including oxidative stress and DNA damage. Notably, benzo[a]pyrene (B[a]P), a representative PAH, is a well-known inducer of the CYP1A1 enzyme, which activates it into a reactive metabolite. In contrast, PCB 138 and PFOS have been shown to reduce induction of CYP1A enzymes. In this study, three representative compounds, B[a]P, PCB 138 and PFOS, were investigated for the potential to reduce cell viability, induce CYP1A1 and generate DNA double strand breaks (DSBs) in the rat hepatoma cell line H4IIE. End points were evaluated following 48 hours of exposure through the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT) assay, the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) assay and gel electrophoresis, respectively. H4IIE cells were exposed to 0.1, 0.505 and 1 µM B[a]P, PCB 138 and PFOS singularly and in 17 ternary mixtures for both cell viability and CYP1A induction assays. DNA DSBs were assessed for mixtures only. Mixtures were designed with a central composite design face centered (CCF). None of the single chemicals seemed to induce CYP1A1 induction. Nonetheless, mixtures with high concentrations of B[a]P and low concentrations of PCB 138 showed increased CYP1A1 catalytic rates, followed by increased DNA-FTM %, for one mixture significantly higher than the control. In contrast, when concentrations of PCB 138 increased in the mixture, CYP1A1 and DNA-FTM % returned to control levels. These results support the hypothesis that PCB 138 is an AhR antagonist and limits the formation of the B[a]P reactive metabolite. Ordinary least square regression (OLS) analyses revealed a negative correlation between the interaction term B[a]P:PCB 138:PFOS and DNA-FTM % suggesting that combinations of the three chemicals in the tested concentrations do not produce reactive oxygen species (ROS) to levels which would induce oxidative stress and increase DNA damage. This study highlights the importance of accounting for chemical interactions, in various combinations, and emphasizes the need for more comprehensive risk assessments that evaluate the effects of combined exposures rather than single chemicals alone.