Characterisation of Liquid-Liquid Phase Separation (LLPS): Establishing a Quantitative Technique for Monitoring LLPS Domains

Abstract

Væske-væske faseseparasjon (LLPS) er prosessen der en homogen løsning eller blanding deler seg i to forskjellige væskefaser, drevet av svake molekylære interaksjoner. Dette fenomenet er antatt å være mekanismen bak dannelsen og funksjonen av membranløse organeller, og er involvert i en rekke biologiske prosesser, inkludert heterokromatindannelse, transkripsjon og autofagi. Tidligere har LLPS blitt studert ved hjelp av kvalitative teknikker eller avbildningsteknikker som baserer seg på fluorescensmerking. I denne studien fokuseres det imidlertid på å bruke kvantitativ faseavbildning (QPI) for å studere LLPS-domener.

Først skulle LLPS induseres i et biopolymer-system. På grunn av rapporterte tilfeller av insulinaggregering ved behandling av pasienter, samt potensialet for LLPS under spesifikke betingelser, ble løsninger med insulin først undersøkt. Hypotesen var at ved å justere pH for å øke ladningen på insulinmolekyler i en løsning, og samtidig skjerme disse elektrostatiske interaksjonene med tilsetning av salt, kunne man oppnå en balanse der man unngår proteinaggregering og oppnår LLPS. Denne metoden lyktes ikke og mulige årsaken kan være en kombinasjon av faktorer som temperatur, proteinkonsentrasjon, saltkonsentrasjon, type salt og/eller pH. En alternativ tilnærming ble deretter forsøkt: å blande adenosintrifosfat (ATP) i basisk løsning med polydiallyldimetylammoniumklorid (PDDA) og overføre den resulterende makrofasen til deionisert vann for å danne LLPS-dråper. Denne metoden viste seg å være vellykket, og faseoppførselen til dette systemet ble videre undersøkt under ulike betingelser, som ulike støkiometriske forhold mellom komponentene, pH og ionestyrker. Dette ga innsikt i betingelsene som er nødvendige for LLPS. De kvantitative fasebildene av PDDA-ATP-dråpene ble analysert for å bestemme radius og tørrmasse. Resultatene av analysen viste at massen i PDDA-ATP-dråpene har en struktur som ligger et sted mellom Gaussian coil-struktur og kompakt sfærisk struktur, noe som er et interessant funn.

QPI er demonstrert som en effektiv kvantitativ teknikk for å studere LLPS. For å oppnå presise resultater må imidlertid metodens begrensninger tas i betraktning. Disse begrensningene inkluderer fasepakning, sfæriske aberrasjoner, samt romlige og temporale oppløsningsgrenser. I denne studien ble et Python-skript utviklet for å redusere artefakter forårsaket av fasepakning, og ImageJ ble brukt for å beskjære bilder som var utsatt for sfæriske aberrasjoner. Temporal oppløsning ansees som tilstrekkelig for å observere dynamikken i disse dråpene, mens den romlige oppløsningen er begrenset av mikroskopet. For fremtidig arbeid foreslås det å kombinere QPI med andre teknikker for å få komplementær innsikt og for å validere resultatene.

Liquid-liquid phase separation (LLPS) is the process where a homogeneous solution or mixture of macromolecules separates into two distinct liquid phases, driven by weak molecular interactions. It is increasingly acknowledged as the mechanism underlying the formation and functions of membraneless organelles and is implicated in various biological processes such as granule assembly, heterochromatin formation, transcription, and autophagy. Traditionally, studying this phenomenon has relied on labeling techniques and fluorescent imaging, or solely qualitative methods. This study, however, focuses on employing quantitative phase imaging (QPI) to monitor LLPS domains.

Initially, LLPS was to be induced in a biopolymer system. Due to the reported formation of insulin aggregates upon injection in patients and the potential for LLPS under certain conditions, insulin solutions were firstly investigated. It was hypothesised that protein aggregation could be avoided and LLPS could be formed by increasing the electric charge of insulin molecules through pH adjustments and screening of these charges by adding salt. Unfortunately, this approach was not successful, possibly due to various environmental factors including temperature, protein concentration, salt concentration, type of salt, and pH. Subsequently, an alternative approach was explored for formation of stable LLPS droplets: mixing adenosine triphosphate (ATP) in an alkaline solution with poly diallyldimethylammonium chloride (PDDA) and transferring the resulting macrophase to deionised water. This method proved successful, and the phase behavior of this system was further investigated under various conditions (e.g. different concentrations, pH, and ionic strengths), providing insights into the conditions necessary for LLPS.

The quantitative phase images of the PDDA-ATP droplets were analysed to determine their size and dry mass. The analysis revealed that the mass fractal of the PDDA-ATP droplets exhibits a structure that is in between a Gaussian coil and a compact globular structure. This indicates non-homogeneity, which is an interesting and notable finding.

With simple, direct and real-time analysis capability, QPI can be utilised for quantifying the LLPS droplets without resorting labeling. However, for the method to provide accurate and precise results, its limitations must be considered. These limitations include phase wrapping, spherical aberrations, and spatial and temporal resolution limits. In the present study, a Python script was developed to mitigate artifacts induced by phase wrapping and ImageJ was used to crop images prone to spherical aberrations. Temporal resolution was not considered a concern due to the slow dynamics of the droplets, whereas the spatial resolution limit is inherent to the microscope system. Therefore, it is suggested for future work to combine QPI with other techniques to gain complementary insights and validate the results.