Studying extracellular matrix formation in preosteoblast 2D and 3D cultures with electron microscopy

Abstract

Styrt beinvevsbygging og regenerasjon, kjent som bone tissue engineering på engelsk, har potensiale til å behandle beinskader, lage sykdomsmodeller for å bedre kunne forske på mekanismene til beinsykdommer og lage bedre medisin testingsenheter enn dagens 2D cellekulturer og dyremodeller. For å oppnå dette må dannelsen og utviklingen av den ekstracellulære matriksen (ECM), spesielt kollagen type I og kalsiumfosfat delene, bli studert for å forstå og kunne utvikle den ønskede vevstypen.

Målet til dette prosjektet var å observere dannelsen av ECM og se på cellenes morfologi, altså cellenes form og struktur, i 3D og 2D cellekulturer med MC3T3-E1 celler. En godt etablert og enkel 2D kultur med MC3T3-E1 celler ble brukt til å oppnå dette for 2D cellekulturer. Målet var å bruke dette som et modell system for å detektere kollagen og kalsiumfosfat mineraler med skanne elektronmikroskopi (SEM), alizarin rød S (ARS) farging, koherent anti-Stokes Raman spredningsspektroskopi (CARS), og energi sprednings røntgen spektroskopi (EDS). For 3D kulturene var målet å undersøke dannelsen av ECM og morfologien til cellene i sfæroider. Fordi sfæroider er 3D strukturer vil mikromiljøet i sfæroidene være mer likt miljøet i kroppen den vanlige 2D cellekulturer. Håpet var å se kollagen fibriller og deres struktur i sfæroidene. Sfæroiden ble lagd ved å ha cellene i agarose former med brønner hvor cellene formet sfæroider. Etter 24 timer ble sfæroidene høstet og innkapslet i alginatgelér og dyrket med osteogent differensieringsmedium eller vekstmedium. Alginatgelene fungerte som et stilas for sfæroidene. Transmissions elektronmikroskopi (TEM) ble valgt som den foretrukne mikroskopiteknikken til å studere ECM på grunn av den høye oppløsningen og muligheten for detaljerte mikrografier av cellene og ECM.

Kollagen fibriller ble observert etter 14 dager med dyrkning i 2D cellekulturene med osteogent differensieringsmedium. Kalsium mineralisering ble påvist med ARS etter 21 dager med dyrkning i differensieringsmedium og områdene med ARS farging overlappet med områdene med fosfat som ble målt med CARS. Det indikerer at CARS kan bli en ny fargefri metode for å observere kalsium fosfat mineralisering i cellekulturer. Det ble også detektert noe kalsium med EDS etter 21 dagers dyrking i differensieringsmedium. Kollagen og kalsiumfosfat ble ikke observert i prøvene dyrket i vekstmedium.

Kollagen fibriller ble observert i 3D kultur sfæroidene dyrket i osteogent differensieringsmedium etter 7 dager. Flere og større fibriller med større diameter ble observert etter 14 dager med dyrking. Sfæroidene o differensieringsmedium ble også observert til å ha en rundere og jevnere overflate enn sfæroidene i vekstmedium. 3D prøvene viste et stort potensiale i å utvikle bein ECM og kan bli brukt videre for å utvikle et konstruert beinvev.

Bone tissue engineering has the potential to treat bone injuries, create disease models to better study bone disease mechanisms, and create drug testing platforms to improve the drug screening of potential new drugs better than the current 2D cultures and animal models. To achieve this, the formation and development of the extracellular matrix (ECM), especially the collagen type I and calcium phosphate components, need to be studied to understand and develop the desired tissue.

The goal of this project was to observe the formation of ECM and cell morphology in 3D and 2D cultures of MC3T3-E1 cells. A well-established and simple 2D culture of MC3T3-E1 cells was used to achieve this for the 2D cultures. The goal was to use this as a model system to detect collagen and calcium phosphate minerals with scanning electron microscopy (SEM), alizarin red S (ARS) staining, coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy (CARS), and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS).

For the 3D cultures, the goal was to investigate the formation of ECM and the morphology of the cells in spheroids. Since spheroids are 3D structures, the microenvironment in the spheroids is more similar to the environment in vivo than regular 2D cultures. The hope was to see the structure of collagen fibrils in the spheroids. The spheroids were made by seeding the cells in agarose molds with wells where the spheroids were formed. After 24 hours the spheroids were harvested and embedded into alginate hydrogels and cultured with osteogenic differentiation media or growth media. The alginate served as a scaffold for the spheroids. Transmission electron microscopy (TEM) was chosen as the preferred microscopy technique to study the ECM, because of the high resolution and the possibility for detailed micrographs of the cells and ECM.

Collagen fibrils were observed after 14 days in the 2D culture with osteogenic differentiation media. Calcium mineralization was detected with ARS after 21 days of culture in differentiation media and the areas with ARS stain matched the areas with the phosphates detected with CARS, indicating that CARS could be a new stain-free method to image calcium phosphate in cell cultures. EDS also detected some calcium after 21 days of culture in differentiation media. No collagen fibrils or mineralization were observed in the samples cultured with growth media.

Collagen fibrils were detected in the 3D cultured spheroids cultured in osteogenic differentiation media after 7 days. More fibrils with a bigger diameter were observed after 14 days of culture. The spheroids in differentiation media were also observed to be rounder and have a smoother surface than the spheroids in growth media. The 3D samples showed great promise in developing bone ECM and could be used further to develop tissue-engineered bone.