Investigating the Impact of Extended Stagnation on Legionella spp. in Premise Plumbings Without Residual Disinfectants

Abstract

Legionella er en gruppe opportunistiske, vannbårne bakterier som kan forårsake den potensielt dødlige sykdommen legionellose. Hver år registreres det flere smittetilfeller av Legionella i Norge. Infeksjon av mennesker sjer gjennom innånding av vanndråper fra kilder tilknyttet drikkevannsnettet, slik som dusj, boblebad eller andre liknende installasjoner. Flere faktorer kan øke risikoen for vekst av Legionella i bygninger, inkludert stagnasjon av vann i rørene eller plasseringen av rørene i nærheten av varmekilder i huset (legionella foretrekker varmere vekstbetingelser). For øyeblikket er det en utfordring å oppdage oppblomstring av legionella i rørsystemene, da standardiserte metoder for å identifisere legionella er svært tidskrevende. Ofte tar det flere dager før prøvesvarene er klare.

Målet med denne masteroppgaven er å bidra i utviklingen av et verktøy som evner å raskt identifisere legionellabakterier i vannprøver. I løpet av masterarbeidet ble det brukt et digitalt PCR instrument for å fastslå den nøyaktige konsentrasjonen av legionella-baktereier i vannprøver tatt fra en pilot som simulerer et dusjanlegg. Disse vannprøvene hadde gjennom tidligere arbeid blitt analysert ved flowcytometri og en predikativ modell som estimerer legionella konsentrasjonen basert på data fra flowcytometer instrumentet. I digital PCR teknologi blir DNA sekvenser fordelt og videre partisjonert i små kamre, der individuelle PCR reaksjoner (amplifikasjon eller økning av DNA tråder) foregår, som gjør absolutt kvantifikasjon av bakterier mulig gjennom Poisson statistikk. Den nye analysen utført av dPCR-instrumentet hadde som mål å gi ytterligere innsikt i modellens prediksjoner, gjennom absolutt kvantifikasjon av legionella konsentrasjonen. Gensekvensene som ble amplifisert i dette forsøket var ssrA-genet og mip-genet, som er gjenkjennende for henholdsvis alle legionella bakterier (ssrA) og den spesifikke arten Legionella pneumophila (mip).

Første del av forsøksperioden bestod i å trekke ut DNA fra de 50 vannprøvene fra pilot-anlegget som hadde blitt filtrert og lagret. Deretter gjensto arbeidet med dPCR instrumentet, som først involverte en introduksjon og en test-kjøring, der to av prøvene fra piloten ble inkludert i platen som settes inn i instrumentet. Resultatene fra test-kjøringen viste at for få DNA-tråder ble ampflifisert til at legionella-konsentrasjonen kunne bli kvantifisert, og dermed krevde metoden noen justeringer. Disse justeringene ble foretatt etter resultatene fra en standard plate ga indikasjoner på hvilke endringer som var nødvendige. Prøvene fra piloten ble insatt i dPCR instrumentet i en plate med 96 kamre, der prøvene blir fordelt, slik at noen prøver ble duplikert. Resultatene fra dPCR amplifikasjonene blir gjort tilgjengelige i et software system tilknyttet instrumentet. Enkelte kamre inneholt prøver med luftbobler, som førte til at noen kamre ikke ga resultat, mens andre ga resultat med lavere validitet. Prøver med resultat som ikke tilfredstilte egensatte krav til validitet ble eksludert fra videre analyser.

Resultatene avviste at legionella pneumophila var tilstede i pilot-anlegget. For å forstå og sammenlikne dPCR resultatene med modellen, ble resultatene visualisert i flere grafer. På forhånd ble det forventet at modellen ville gi best samsvar med lavere konsentrasjoner, mens det kunne være større avvik ved konsentrasjoner rundt 7 log ssrA/L. Antagelsen skyldtes at modellen var trent på data med legionella-konsentrasjoner opptil 7 log ssrA/L. Det viste seg likevel at modellen avviket størst i området med lavere konsentrasjoner, altså i bakterienes vekst-fase. Alt i alt samsvarte trenden til bakterievekstkurvene, selvom konsentrasjonene kvantifisert ved dPCR var generelt noe lavere enn de predikert av modellen. Det var usikkerheter knyttet til hvordan modellen ville prestere når konsentrasjonene overkredet 7 log ssrA/L, men dPCR resultat viste at det var ingen prøver som hadde så høye konsentrasjoner av legionella. Videre arbeid med dPCR instrumentet anbefales for å optimalisere metoder, utvikle bredere forståelse av resultater og få mer erfaring med teknologien. Denne erfaringen kan utnyttes til å viderutvikle modellen, samt utvide forståelsen av legionella bakteriene.

Legionella bacteria are a group of opportunistic waterborne bacteria capable of causing Legionellosis, a potentially fatal disease. In Norway, there are several cases of infection reported yearly. Human infection occurs through inhalation of water droplets from installations linked to the drinking water distribution network, including showers, bath tubs and other man-made systems. Factors like water stagnation and higher temperatures in buildings lead to an increased chance of Legionella proliferation within plumbing systems.

The objective of this masters thesis is to contribute to the development of a tool that rapidly detects Legionella bacteria in water. During the masters work a digital PCR instrument was utilized to accurately quantify Legionella concentrations in water samples previously obtained from a pilot shower rig. These samples had undergone analysis using flow cytometry (FCM) and a predictive model that estimates the Legionella concentrations for each sample, based on the FCM data. In digital PCR, target sequences of DNA are partitioned in small wells, amplified and detected, and the bacterial concentration is quantified using Poisson statistics. The new analysis by the dPCR instrument aimed to provide additional insights into the model’s predictions. The selected target genes for dPCR were the ssrA gene and the mip gene, for detecting Legionella bacteria and the Legionella pneumophila species, respectively.

During the experimental period, DNA was first extracted from 50 water samples that had previously been analysed by FCM. Initiating the work with dPCR, a test run of several samples was conducted, which included two of these samples. However, the test plate did not yield sufficient amplification to detect and quantify the target DNA. Therefore, before continuing with the samples, a standard plate was designed to improve the methodology. After discovering and making the necessary adjustments to the methodology, all samples were prepared for dPCR and randomly distributed across a 96-well plate, with most of the samples being duplicated. Due to experimental errors, certain wells contained air bubbles, resulting in some wells not yielding any results and others producing quantifications with lower validity. Based on the distribution of the number of valid partitions, which forms the foundation for Poisson statistics, a threshold for acceptable samples was established. Wells containing non-valid samples were excluded from the analysis.

From the pilot, no Legionella pneumophila was detected. To visualize and compare the predicted total Legionella concentrations of the model with the quanitification by dPCR, several plots were created. The model was trained on concentrations reaching up to approximately 7 logs ssrA/L. Therefore, its predictions were expected to deviate at concentrations around 7 logs, while performing more accurately on lower concentrations. However, this hypothesis was contradicted, as the largest deviations between the model and dPCR were observed in the bacterial growth phase, where the concentrations are lower. Overall, the general trend of the two growth curves is similar, indicating that even after a prolonged period of water stagnation, Legionella bacteria persist. In addition, the model predicts concentrations within a similar range as quantified by dPCR. However, as there where no concentrations quantified by dPCR above approximately 6.5 logs ssrA/L, there are still uncertainties regarding to how well the model predicts concentrations at higher ranges. Further work on becoming familiar with the dPCR instrument, optimizing the methodology, and gaining experience in interpreting the results is recommended. This knowledge can then be utilized in future efforts to develop the Legionella predicative model, and enhance the understanding of Legionella bacteria.