Mechanical and Physical Characterization of Compressed Alginate Hydrogels

Abstract

Når man utvikler nye biomaterialer som skal brukes til langsiktig gjenoppretting av tapt funksjon i dynamiske fysiologiske miljøer eller for å fremme varig vevsregenerering, er det viktig å tilpasse materialets mekaniske egenskaper til de spesfikke funksjonelle kravene i anvendelsen. Til tross for omfattende forskning på alginathydrogeler er det imidlertid lite som vites om hvordan de oppfører seg under deformasjon utover de initielle deformasjons- stadiene eller før de når bruddstyrke. Derfor har denne masteroppgaven hatt som mål karakterisere de mekaniske og fysiske egenskapene til komprimerte alginathydrogeler, ettersom kompresjonskrefter på grunn av fysiologiske bevegelser, samt indre og ytre trykk, er forventet i in vivo-applikasjoner. For å undersøke dette ble ulike typer kalsiumalginat- hydrogeler, blant annet stilkalginat med høy molekylvekt og høyt guluronat innhold (HiG), bladalginat med høy molekylvekt og middels guluronat innhold (IntG) og stilkealginat med lav molekylvekt og høyt guluronat innhold (HiG-LMw), produsert fra Laminaria hyperborea. Dette ble gjort for å undersøke hva effekten av å variere fysiske faktorer som G-innhold, alginatkonsentrasjon og molekylvekt hadde på gelens oppførsel etter en serie med enakset høybelastningskompresjoner.

En teksturanalysator ble brukt til enakset kompresjon av gelene, hvor hver gel ble komprimert to ganger til en belastning på 50% hver gang. Til tross for denne høye kompresjonen ble det observert for begge kompresjonene at 1.0% (w/v) og 2.0% (w/v) HiG- og IntG-geler ekspanderte i høyden etter at kompresjonskraften ble fjernet. Omfanget av denne høydegjennopprettingen var svært lik mellom gelene, uavhengig av varierende alginatkonsentrasjon og G-innhold. Under kompresjonsmålingene ble det observert lekkasje av vann fra gelene etter hvert som trykket ble påført, noe som førte til en reduksjon i gelvolumet. Målinger av denne reduksjonen i gelvolumet etter kompresjon viste lignende trender til hva som er kjent å skje ved synerese i alginatgeler etter geling og kalsiummetning. Høyere alginatkonsentrasjon og G-innhold førte til en mindre reduksjon i volum. En mer detaljert analyse av reduksjonen i gelvolumet i stegene etter geling til etter den andre kompresjonen viste imidlertid at kompresjon ikke nødvendigvis er den viktigste faktoren som påvirker graden av reduksjon i hydrogelvolumet. Kalsiummetningen så derimot ut til å ha en større innvirkning på reduksjonen. Gelens styrke ble videre undersøkt ved å studere Youngs modul, som beskriver stivheten til hydrogelnettverk. For alginatgeler korrigeres Youngs modul normalt for den økte alginatkonsentrasjonen som følge av den nevnte reduksjonen i gelvolumet. Gjennom innsikt i den ukorrigerte og korrigerte modulen ble det observert hvordan bruk av korreksjonsfaktorer minimerte forskjellene i modul ved første og andre kompresjon, og hvordan forskjellene i parametere, som molekylvekt, var mindre signifikante. Modulen varierte fra 21.0 til 85.3 kPa før korrigering og 7.4 til 35.9 kPa etter korreksjon, noe som fremhever hvordan alginatsammensetning og korreksjonsfaktorer i stor grad påvirker den estimerte gelstyrken. Når det gjelder gelstabilitet, kan ulikheten som ble observert i vektendring etter behandling med fysiologisk saltvann mellom 1.0% (w/v) og 2.0% (w/v) HiG- og IntG-geler indikere variasjoner i stabilitet basert på G-innhold, ettersom IntG-geler viste en vektøkning og HiG-geler en vektreduskjon. For å videre undersøke hvordan de fysiske og mekaniske egenskapene endret seg i et miljø som ligner på fysiologiske forhold, ble gelene eksponert for 0.9% (w/v) NaCl i en lengre periode før komprimering. Dette resulterte i geler med høyere elastisitet enn tidligere observasjoner, og en mer tydelig forskjell mellom HiG- og IntG-geler i evnen til å gjenopprette noe av den opprinnelige høyden. Dette kan tyde på at geler med lavere kryssbindingstetthet, på grunn av utveksling av kalsiumioner med natriumioner, viser minimale endringer i formen etter kompresjon som et resultat av mindre stive og mer fleksible geler. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i gelvolumreduksjon sammenlignet med geler uten en 0.9% (w/v) NaCl førbehandling. En 24-timers behandling med fysologisk saltvann etter komprimering viste imidlertid en høyere vektøkning for både HiG- og IntG-geler sammenlignet med det som ble sett tidligere, noe som indikerer en lavere stabilitet for komprimerte geler med 0.9% (w/v) NaCl førbehandling. Youngs modul ble også redusert til mellom 7.5 og 49.0 kPa før korreksjon, og til mellom 1.7 og 23.1 kPa etter korreksjon, noe som understreker at gelene blir mykere ved eksponering av fysologisk saltvann. Det er interessant å merke seg at modulen også ble redusert ved den andre kompresjonen sammenlignet med økningen som ble sett i geler uten forbehandling med fysologisk saltvann, noe som også kan ha sammenheng med de strukturelle endringene i gelen som følge av denne eksponeringen. Til slutt ble et konfokalt laserskanningsmikroskop brukt til å bestemme hvordan alginatfordelingen endret seg etter kompresjon av umettede og mettede 1.0% (w/v) HiG-geler som inneholdt 10% fluorescensmerket materiale. Resultatene viste en høyere konsentrasjon i den nedre delen av gelen etter kompresjon for mettede geler. Dette kan muligens kobles til deres høyere kryssbinindg sammenlignet med umettede geler, hvor det ikke ble observert noen signifikante endringer etter komprimering.

Oppsummert har dette arbeidet belyst de mekaniske og fysiske egenskapene til komprimerte alginathydrogeler og vist hvorfor denne kunnskapen er viktig i utviklingen av fremtidens biomaterialer. Mekanisk responsive biomaterialer har fordelen at de kan endre egenskapene sine som respons på miljøstimuli, for eksempel trykk, noe som er en fordel i ulike medisinske anvendelser med dynamiske fysiologiske miljøer. Videre forskning bør fokusere på å skreddersy gelene for å sikre at materialet er biokompatibelt og oppfyller de funksjonelle kravene som er nødvendige for å fremme det ønskede terapeutiske resultatet.

When developing new biomaterials for long-term restoration of lost function in dynamic physiological environments or for promoting long-lasting tissue regeneration, an important aspect is to match the material’s mechanical properties to the functional requirements of the application. However, despite extensive research on alginate hydrogels, little is known about their behavior under deformation beyond the initial deformation stages or before reaching failure strain. Therefore, this thesis aimed to characterize the mechanical and physical properties of compressed alginate hydrogels, as compression forces due to physiological movements, as well as internal and external pressure, are expected in in vivo applications. To address this, different types of calcium-alginates hydrogels were prepared, including high molecular weight, high guluronate content stipe alginate (HiG), high molecular weight, intermediate guluronate content leaf alginate (IntG) and low molecular weight, high guluronate content stipe alginate (HiG-LMw), from Laminaria hyperborea. This was done to investigate the effect of varying physical factors such as G-content, alginate concentration, and molecular weight on the behavior of the gel after a series of high-strain uniaxial compressions.

A Texture Analyzer (TA) was employed for uniaxial compression of the gels, with each gel compressed twice to a strain of 50%. Despite this high-strain compression, it was observed for both compressions that 1.0% (w/v) and 2.0% (w/v) HiG and IntG gels expanded in height after the compression force was withdrawn. The extent of height recovery following each compression was similar between the gels regardless of varying alginate concentration and G-content. During the compression measurements, water leaked from the gels as pressure was applied, leading to a decrease in the gel volume. Measurements of this gel volume reduction after compression showed similar trends to the known behavior of syneresis of alginate gels occurring after gelation and calcium saturation. Specifically, higher alginate concentration and G-content were associated with a smaller decrease in volume. However, a more in-depth analysis of gel volume reduction after gelation to after the second compression revealed how compression itself may not be the primary factor affecting the degree of decrease in hydrogel volume. Rather, calcium saturation appeared to have a more significant influence on the reduction. Gel strength was further investigated by looking into Young’s modulus, which describes the stiffness of hydrogel networks. For alginate gels, Young’s modulus is normally corrected to the increased alginate concentration from the mentioned gel volume reduction. Insights into the non-corrected and corrected modulus revealed how applying correction factors minimized the differences in the modulus at the first and second compressions and how the differences in parameters, such as molecular weight, were less significant. The modulus ranged from 21.0 to 85.3 kPa before applying correction factors and 7.4 to 35.9 kPa after correction, highlighting how alginate composition and correction factors greatly affect the estimated gel strength. In terms of gel stability, differences were observed in weight change between 1.0% (w/v) and 2.0% (w/v) HiG and IntG gels following a 24-hour saline treatment after compression. This indicates variations in stability based on G-content, as IntG gels exhibited a higher weight increase than HiG gels. To further investigate how the physical and mechanical properties changed in an environment similar to physiological conditions, the gels were exposed to 0.9% (w/v) NaCl for a prolonged period before compression. This resulted in gels with higher elasticity than earlier observations and a more pronounced difference between HiG and IntG gels in the ability to regain their original dimensions. This could suggest that gels with lower cross-linking density, due to the exchange of calcium ions with sodium ions, exhibit minimal changes in shape after compression due to less rigid and more flexible gels. No significant difference in gel volume reduction was observed compared to gels without saline pretreatment. However, a 24-hour saline treatment after compression showed a higher weight increase for both HiG and IntG gels than what was seen earlier, indicating lower stability for compressed saline-pretreated gels. Young’s modulus also decreased to a range of 7.5 to 49.0 kPa before applying correction factors and to a range of 1.7 to 23.1 kPa after correction, highlighting that saline exposure softens the gels. Interestingly, the modulus also decreased at the second compression compared to the increase seen in gels without saline pretreatment, which could also be linked to the structural changes in the gel induced by exposure to physiological saline. Lastly, a confocal laser scanning microscope (CLSM) was used to determine how alginate distribution changed following compression of unsaturated and saturated 1.0% (w/v) HiG gels containing 10% fluorescence labeled material. The results revealed a higher concentration in the lower part of the gel after compression for saturated gels. This could possibly be attributed to their higher cross-linking density compared to unsaturated gels, where no significant changes were observed after compression.

In summary, the work herein has been done to elucidate the mechanical and physical properties of compressed alginate hydrogels and highlight why this knowledge is important in developing biomaterials for the future. Mechanically responsive biomaterials have the advantage of changing their properties in response to environmental stimuli such as pressure, which is an advantage in various medical applications with dynamic physiological environments. Further research should focus on tailoring the gels to ensure that the material is biocompatible and meets the functional requirements needed to promote the desired therapeutic outcome.