epegRNA Screening Platform for Primary Immunodeficiency Mutations in HEK293 cells and Hematopoietic Stem and Progenitory Cells (HSPCs)

Abstract

Mangel på adenosindeaminase (DADA2) er en primær immunsvikt forårsaket av autosomale recessive mutasjoner i adenosindeaminasegen (CECR1, ADA2). Korrekte behandlingsmetoder er først og fremst avhengig av sykdomsfenotypen, og understreker behovet for målrettet genkorreksjon. Prime editing (PE) er et allsidig genomredigeringsverktøy som er i stand til å introdusere innsetting, sletting, alle 12 typer nukleotidendringer og kombinasjoner derav. PE kan potensielt korrigere opptil 90 % av genetiske lidelser, inkludert primære immunsvikt. Evaluering av redigeringseffektiviteten til prime-redigeringsguidRNA (pegRNA) krever imidlertid betydelig innsats. I denne studien beskriver vi en optimalisert prime-redigeringsscreeningsplattform for å vurdere redigeringseffektiviteten til grunnleggende (pegRNA) og konstruert pegRNA (epegRNA) rettet mot pR169Q-mutasjon i ADA2 (ENSG00000093072). Vi evaluerte sekvensriktigheten til epegRNA- og pegRNA-plasmidbiblioteket ved Sanger-sekvensering og genererte lentivirusbiblioteker. Vi evaluerte også den smittsomme titeren ved bruk av digital dråpe-PCR (ddPCR), genererte cellebiblioteker for stabil ekspresjon av epegRNA og pegRNA, og optimaliserte PCR-forholdene for dyp amplikonsekvensering. Vi demonstrerte en ddPCR-basert tilnærming for å kvantifisere lentivirus-kopinummer med høy sensitivitet og lavt standardavvik. Det dynamiske området for ddPCR var mellom 300 og 30 000 målkopier per reaksjon, som ble brukt til estimering av kopiantallvariasjon, beregning av infeksiøs titer og infeksjonsmangfold for epegRNA- og pegRNA-cellebibliotek-preparat. Vi observerte at PCR-tilstanden brukt med epegRNA-plasmid ikke var forenlig med gDNA oppnådd fra cellebiblioteket når biblioteket ble klargjort for amplikonsekvensering. Oppsummert la denne studien grunnlaget for pålitelig og effektiv screening av epegRNA og pegRNA. Vi fremhevet viktigheten av å optimalisere PCR-forhold for amplikonsekvensering. Implementering av denne optimaliserte plattformen lover å effektivisere prosessen med å teste pegRNA-er for monogene mutasjoner.

Deficiency of adenosine deaminase (DADA2) is a primary immunodeficiency caused by autosomal recessive mutations in adenosine deaminase gene (CECR1, ADA2). Correct treatment methods primarily rely on the disease phenotype, emphasizing the need for targeted gene correction. Prime editing (PE) is a versatile genome editing tool capable of introducing insertion, deletion, all 12 types of nucleotide changes and combinations thereof. PE can potentially correct up to 90% of genetic disorders, including primary immunodeficiencies. However, evaluating the editing efficiency of prime editing guidRNA (pegRNA) requires significant effort. In this study, we describe an optimized prime editing screening platform for assessing the editing efficiencies of basic (pegRNA) and engineered pegRNA (epegRNA) targeting pR169Q mutation in in ADA2 (ENSG00000093072). We evaluated the sequence correctness of epegRNA and pegRNA plasmid library by Sanger sequencing and generated lentivirus libraries. We also evaluated the infectious titer using digital droplet PCR (ddPCR), generated cell libraries for stable expression of epegRNA and pegRNA, and optimized the PCR conditions for deep amplicon sequencing. We demonstrated a ddPCR based approach for quantifying lentivirus copy number with high sensitivity and low standard deviation. The dynamic range of ddPCR was between 300 to 30,000 target copies per reaction, which was used for copy number variation estimation, calculation of infectious titer, and multiplicity of infection for epegRNA and pegRNA cell library preparation. We observed the PCR condition used with epegRNA plasmid were not compatible with gDNA obtained from cell library when preparing library for amplicon sequencing. In summary, this study laid the groundwork for reliable and efficient screening of epegRNA and pegRNA. We highlighted the importance of optimizing PCR conditions for amplicon sequencing. Implementation of this optimized platform promises to streamline the process of testing pegRNAs for monogenic mutations.