Enzymatic upgrading of alginate from Alaria esculenta and Saccharina latissma with AlgE6 in process

Abstract

Alginat er et biopolymer som består av $\beta$-D-mannuronsyre(M) og $\alpha$-L-guluronsyre(G). I Norge blir det årlig høstet 150 000 tonn med \textit{Laminaria hyperborea}/stortare(LH) for produksjon av alginat. Alginatet blir produsert fra stipesen/stilken til alginatet, ettersom det har et høy G-innhold, lange G-blokker og høy molekylvekt. Disse egenskapene har gjort alginat produsert fra LH et verdifult polymer med bruksområder både i mat industiren og legemiddel industrien, fordi det høye G-innholdet og lange G-blokkene gjør at alginatet kan lage sterke geler med divalente kationer og øke viskøsiteten til løsnigner. Det er en øvre grense på hvor mye LH som kan bli høstet før det får negative konsekvenser for dyreliv i havet, noe som gjør at andre kilder til alginat må bli utforsket for å møte det økende behovet. både \text{Alaria esculenta} og \textit{Saccharina latissima} har blitt identifisert som potensielle kilder for å supplementere alginat produksjonen. Dessverre er ikke alginatet produksert fra disse kildene perfekte, ettersom de har et lavere G-innhold og kortere G-blokker sammenlignet med LH stipese alginat. Dette kan bli endred ved bruk av C-5 epimeraser, som endrer M langs polymerkjeden til G. Dette har blitt gjort på alginat som først har blitt renset og isolert, noe som er gjør prosessen med tidskreven og kostbar. En ny metode, epimerisering i prosess, prøver å minske tiden som kreves og begrense kostnaddene ved å tilføre et epimeriseringenstrinn direkte i ekstraksjonsprosessen, noe som kan forbedre alginatet produsert fra AE og SL. Ettersom metoden er nokså ny er det viktig å utforske bruken av ulike C-5 epimerases for å finne en god kobling mellom enzym og substrat, samt å endre på variabler for å utforske hvordan prosessen kan bli optimalisert. Denne oppgaven vil utforske bruken av AlgE6 for epimerisering av SL alginat i prosess, og om endring av Na$^+$-ionekonsentrasjon vil ha en effekt på epimerisering av AE alginat i prosess. Til slutt vil oppgaven også se hvordan AlgE6 påvirker gelling egenskapene til alginat fra AE, LH(blad) og SL i buffer og i prosess. $^1$H-NMR ble brukt til å se endringer i G-innhold, SEC-MALS ble brukt til å finne gjennomsnittlige molekylvekter og texture analyser ble brukt til å måle egenskaper som korrigert Young's modulus(E'), synerese, kompresjon ved brudd(CAR) og brytningsstyrke(RS). Data fra $^1$H-NMR viser at AlgE6 klarte å øke G-innhold for SL alginat epimerisert i prosess. Økningen i G-innhold viste også en økning i E' fra 21 kPa til 29 kPa. Minke konsentrasjonen av Na$^+$-ioner førte ikke til en økning i G-innhold for AE alginat med tilført AlgE6 epimerisert i prosess. Alginat gel laget av AE, LH(blad) og SL epimerisert i buffer med AlgE6 hadde alle en økning i E' og en nedgang i synerese, mens endring i CAR og RS varierte mellom de ulike artene.

Alginate is a biopolymer comprised of $\beta$-D-mannuronic acid(M) and $\alpha$-L-guluronic acid(G). In Norway 150 000 tons of wet weight $\textit{Laminaria hyperborea}$(LH) is harvested annually for the production of alginate. The LH stipe alginate has a high G-content(F$_G$=0.68-0.7), long average G-blocks and a high molecular weight M$_w$ = 500 kDa. These properties have made stipe alginate a valuable polymer with many applications, from the food industry to the pharmaceutical industry due to its ability to form strong gels in the presence of divalent cations and its properties as a viscosifier. With an upper limit to the amount of LH that can be harvested before the practice becomes less sustainable, other sources of alginate are needed in order to meet the growing demand. Cultivated species of brown macro algae such as \textit{Alaria esculenta}(AE) and \textit{Saccharina latissima}(SL) have been investigated as potential sources to supplement the production of alginate. However, alginates extracted from these species have a lower G-content compared to the LH stipe alginate, decreasing their marked value. This can be addressed by using C-5 epimerases, which converts M-residues along the polymer to G-residues. To do this, the alginate needs to be purify and isolate beforehand, which is time consuming and not as cost efficient as production from LH stipe. Epimerization in process aims to introduce an epimerization step during the extraction of alginate, to decrease the costs and time needed, which could make production of alginate from AE or SL a viable option. As the method is quite novel, it is important to investigate the use of different C-5 epimerases, how changing variables such as the salt concentration affect the process, and the gelling properties of the epimerized alginate. This thesis will investigate the use of AlgE6 for epimerization in process of SL alginate, if changing the concentration of NaCl will improve the epimerization of AE in process and how AlgE6 affects gel properties of alginates extracted from AE, LH(leaf) and SL. $^1$H-NMR spectroscopy was used to investigate the change in M/G composition, SEC-MALS was used to find the number average molecular weight (M$_n$) and weight average molecular weight (M$_w$), and a texture analyser was used to investigate corrected Young's modulus(E'), syneresis, compression at rupture (CAR) and rupture strength(RS). Results from $^1$H-NMR showed that AlgE6 was successful in increasing the G-content of SL alginate in process. Epimerization in process of SL with AlgE6 also increased E' from 21 kPa to 29kPa. Decreasing the added NaCl concentration did not increase the G-content during "epimerization in process" of AE alginate with AlgE6. Gels made from AE, LH(leaf) and SL epimerized with AlgE6 in buffer all had increases in E' and decreases in syneresis, but showed conflicting trends in CAR and RS.