Development and evaluation of Bacillus methanolicus strains optimised for industrial applications

Abstract

B. methanolicus har flere fordeler som produksjonsstamme innen bioteknologi. Først og fremst metylotrofi, evnen til å metabolisere metanol, gir betydelige fordeler for bioindustrien. Tradisjonelle cellefabrikker er avhengige av fôrressurser avledet fra nyttevekster. Metanol på sin side produseres billig, uten å konkurrere med matindustrien og kan fremstilles karbonnøytralt. B. methanolicus har vist seg å være nyttig for overproduksjon av aminosyrer så vel som eksogene forbindelser som kadaverin, GABA eller acetoin. Den genetiske verktøykassen for B. methanolicus utvides stadig, CRISPRi og pDELxp-oroP selvmordsvektorer har blitt brukt til henholdsvis gen-slukking og -delesjoner.

Målet i denne studien var å konstruere en stamme av B. methanolicus tilpasset industrielle anvendelser ved å fjerne gener som er involvert i produksjon av sporer, autolysering og DNA-reparasjon. Genene spoIV, spo0A og ykfA ble slettet fra B. methanolicus kromosomet ved hjelp av selvmordsvektorer basert på pDELxp-oroP-plasmider. Sporløs gen-delesjon ble oppnåd som en følge av to homologe rekombinasjonshendelser og bruk av et motseleksjonssystem (oroP og 5-FO). Delesjon av spoIV genet endret ikke veksthastighet, spore- eller biofilm-dannelse betydelig noe som antyder at spoIV ikke er nødvendig for produksjon av funksjonelle sporer i B. methanolicus. ΔykfA-mutanten viste tilsvarende veksthastigheter som MGA 3. Det ble ikke observer reduksjon av lysering under dødsfasen, noe som antyder at flere autolytiske gener må fjernes for å redusere autolyse betydelig eller at ykfA kan spille en rolle i peptidgjenvinningsveier i stedet for autolyse. Delesjon av spo0A resulterte i fullstendig asporogeni, og bekrefter dens rolle som et høy-nivå sporuleringsregulator. Mutanten viste økte nivåer av biofilm sammenlignet med villtypen. Veksthastigheten til Δspo0A endret seg ikke signifikant fra villtypen, noe som gjør den til en lovende stamme for å skape en industriell arbeidshest.

The bacterium B. methanolicus has several advantages as a production strain for biotechnology. Chief among these is methylotrophy, the capacity to metabolize methanol, confers significant benefits to the bioindustry, particularly since traditional cell factories rely on crop-derived sugars. Methanol on the other hand is produced cheaply, without competing with food production and can be carbon neutral. B. methanolicus has been proven useful for overproduction of ammino acids as well as non-native compounds such as cadaverine, GABA or acetoin. The genetic toolbox for B. methanolicus is expanding, CRISPRi and pDELxp-oroP suicide vectors have successfully been used for gene silencing and deletions, respectively.

This study aimed to engineer a strain of B. methanolicus tailored for industrial applications by targeting genes involved in sporulation, DNA repair, and cell autolysis. The genes spoIV, spo0A and ykfA were successfully deleted from the bacterial chromosome using suicide vectors based on pDELxp-oroP plasmids, this archived scarless gene deletions facilitated by two homologous recombination events and a counterselection system (oroP and 5-FO). Deletion of spoIV did not significantly alter growth rate, asporogeny, or biofilm formation, implying it is not needed for functional spore formation in B. methanolicus. The ΔykfA strain exhibited comparable growth rates to the wild type, but no reduction in autolysis, suggesting that either multiple autolytic genes need to be targeted to reduce lysis or that ykfA may play a role in peptide recycling pathways instead of autolysis. Deletion of spo0A resulted in complete asporogeny, confirming its role as a high level sporulation regulatory gene. The strain exhibited increased level of biofilm compared to the wild type. The growth rate of Δspo0A did not significantly alter from the wild type thus it does not seem to be detrimental to strain fitness making it a promising strain for creation of an industrial workhorse.