Unveiling the Potential of Extremolytes: Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for Thermal Stress Resistance

Abstract

Mikrobielle cellefabrikker har blitt bærekraftige alternativer til tradisjonelle produksjonsprosesser ved å produsere verdifulle stoffer som kjemikalier, legemidler og biodrivstoff. Til tross for deres potensial møter industrielle anvendelser betydelige utfordringer, spesielt knyttet til miljøtilpasning og prosessoptimalisering. Temperaturvariasjoner i storskala fermenteringsprosesser krever utvikling av termotolerante mikrobielle stammer for å forbedre stabiliteten og redusere kjølekostnadene. Denne studien tar for seg disse utfordringene ved å utvikle bioteknologiens arbeidshest Corynebacterium glutamicum til å produsere de kompatible stoffene ektoin og hydroksyektoin, kjent for sine termiske stresstoleranseegenskaper. Ved å overuttrykke de hydroksyektoin-biosyntetiske genene ask, ectAB, ectC og ectD fra Pseudomonas stutzeri ble det forsøkt å forbedre termotoleransen til C. glutamicum, som har en optimal veksttemperatur på 30 °C. En kombinatorisk tilnærming ble brukt for å lage et bibliotek av syntetiske operoner med varierende translasjonsinitieringsrater for hvert gen, slik at det ble mulig å velge stammer med spesifikke hydroksyektoin/ektoin-produksjonsforhold, som forbedret vekst ved suboptimale temperaturer. Den konstruerte stammen, CgHect, demonstrerte robust vekst ved 40 °C, med en biomasseproduksjon på 5,4 ± 0,4 g/L og en vekstrate på 0,26 ± 0,01 1/t fra 1 % glukose som eneste karbonkilde. Sammenlignet med villtypen av C. glutamicum (C.glutamicum(pECXT99a)), som produserte 1,7 ± 0,3 g/L biomasse og hadde en vekstrate på 0,12 ± 0,01 1/t, representerer dette et betydelig gjennombrudd innen mikrobiell bioteknologi. Den termotolerante naturen til den konstruerte stammen gir potensielle fordeler som reduserte kjøle behov og minimert kontamineringsrisiko, noe som kan forbedre effektiviteten og bærekraften i industrielle prosesser. I tillegg har produksjonen av ektoin og hydroksyektoin betydelig kommersiell verdi i industrier som kosmetikk, legemidler og bioteknologi. Totalt sett bidrar denne studien til utviklingen av miljøvennlige og effektive bioproduksjonsmetoder, som møter de skiftende behovene til ulike sektorer avhengige av stressbeskyttere og stabilisatorer.

Microbial cell factories have emerged as sustainable alternatives to traditional manufacturing processes, producing valuable substances such as chemicals, pharmaceuticals, and biofuels. Despite their promise, industrial applications face significant challenges, particularly regarding environmental adaptation and process optimisation. Temperature fluctuations in large-scale fermentation processes require the development of thermotolerant microbial strains to enhance stability and reduce cooling costs. This study addresses these challenges by engineering the biotechnology workhorse Corynebacterium glutamicum to produce the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine, known for their thermal stress tolerance properties. Hence, the overexpression of hydroxyectoine biosynthetic genes ask, ectAB, ectC and ectD from Pseudomonas stutzeri aimed to enhance the thermotolerance of C. glutamicum, which has an optimal growth temperature of 30 °C . A combinatorial approach was used to create a library of synthetic operons with varying translation initiation rates of each gene, allowing the selection of strains with specific hydroxyectoine/ectoine production ratios, which enhanced growth at suboptimal temperatures. The engineered strain, CgHect, demonstrated robust growth at 40 °C yielding a biomass production of 5.4 ± 0.4 g/L and a growth rate of 0.26 ± 0.01 1/h from 1 % of glucose as sole carbon source. Under identical conditions, the C. glutamicum wild type strain (C. glutamicum(pECXT99a)) produced 1.7 ± 0.3 g/L biomass and displayed a growth rate of 0.12 ± 0.01 1/h. This advancement represents a significant breakthrough in microbial biotechnology. The thermotolerant nature of the engineered strain suggests potential benefits such as reduced cooling requirements and minimised contamination risks, potentially enhancing the efficiency and sustainability of industrial processes. Additionally, the production of ectoine and hydroxyectoine holds substantial commercial value in industries such as cosmetics, pharmaceuticals, and biotechnology. Overall, this study contributes to developing eco-friendly and efficient bioproduction methods, addressing the evolving needs of diverse sectors reliant on stress protectants and stabilisers.