Functional Adaptation of Escherichia coli Inducible Promoter Systems for Use in Pseudomonas putida and Bacillus subtilis

Abstract

Mennesker har brukt mikrober i tusenvis av år, og gjør det nå i større grad enn noen gang før. Anvendelsesområdene er mangfoldige, fra småskala fermentering under hjemmebrygging til storskala industriell biosyntese av farmasøytiske forbindelser. De tidligste anvendelsene kom imidlertid fra tilfeldige oppdagelser som var få og spredte. Syntetisk biologi som disiplin har åpnet veien for hurtig utvikling av mikrobiel ingeniørkunst for spesifikke nye formål, som produksjon av humant insulin gjennom tarmbakterien, Escherichia coli (E. coli). Genetisk forskning har fått et banebrytende verktøy i syntetisk biologi, som muliggjør uttrykk av gener på tvers av flere mikrobielle arter. Induserbare genuttrykksystemer er et godt eksempel. Disse systemene gir oss mulighet til å kontrollere uttrykket av et gen av interesse i vertsmirober, ved å justere konsentrasjonen av et lite indusermolekyl i kulturmediet.

I denne oppgaven undersøker jeg tilpasningsgraden til velkarakteriserte E. coli indusersystemer for bruk i nye verter, Pseudomonas putida (P. putida) og Bacillus subtilis (B. subtilis). Adapsjon ble gjort ved å introdusere nye vertsoptimaliserte promotorer i stedet for de iboende induserbare systempromotorene. To promotorer i hvert system var mål for optimalisering. En av promotorene styrer uttrykket av den induserbare Transkripsjonsfaktor (TF). TFen regulerer transkripsjonen fra den induserbare promotoren, som styrer uttrykket av reportergenet. Disse systemene induceres av følgende seks indusere: Vanillinsyre (Van), Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG), 4-isopropylbenzosyre (Cuma), 3,4-Dihydroksybenzosyre (DHBA), Anhydrotetrasyklin hydroklorid (aTc) og l-Arabinose (Ara). Nye promotorer ble forhåndsgenerert ved hjelp av en prediktiv Transformer-basert kunstig intelligens. Resultatene viser varierende nivåer av suksess.

Adaptasjonen for P. putida resulterte i økte induksjonsnivåer for aTc-systemet da det ble dyrket i 0,2 μM aTc, noe som ikke ble overført til 2,0 μM. Da jeg sammenlignet med data fra E. coli generert for denne oppgaven, viste IPTG- og Ara-systemene direkte kompatibilitet med P. putida uten optimalisering. Adaptasjon ga ikke forhøyet induksjon. Van-, Cuma- og DHBA-systemene viste ikke direkte kompatibilitet, og adaptasjon indikerte ikke forhøyet induksjon i P. putida.

Cuma-systemet var det eneste systemet jeg testet for kompatibilitet med B. subtilis. Heterolog yfp ble testet for funksjonalitet på tvers av arter ved å først klone et B. subtilis gfp-derivat av Cuma-systemet. Jeg utviklet konstitutivt aktive P43-derivater av disse induserbare systemene for det samme formålet. Mutasjoner i reportergene og fravær av en nødvendig tilleggssekvens for promotoren, reduserte sannsynligvis fluorescensnivåene ned til de negative kontrollene. Jeg klonete et konstitutivt aktivt derivat med klonet yfp under kontroll av Pveg. Dette systemet utøvde ikke høyere fluorescens enn negativ kontroll. Dette tyder på at heterolog yfp ikke kan benyttes som reporter i B. subtilis. Jeg foreslår å klone et homologt B. subtilis reportergen inn i det samme Pveg-systemet for å innhente ytterligere bevis for disse funnene.

Humans have been utilising microbes for thousands of years and do so now more than ever. The applications are multifaceted, ranging from small-scale fermentation during homebrewing to the large-scale industrial biosynthesis of pharmaceutical compounds. Historically, many early applications resulted from accidental discoveries, occurring infrequently. The discipline of synthetic biology has opened up the path of fast-paced microbial engineering for specific and novel purposes, such as the production of human insulin in the gut microbe, Escherichia coli (E. coli). Genetic research has acquired a fundamental tool in synthetic biology, enabling the expression of genes across multiple microbial species. Inducible gene expression systems are a profound example, empowering us to control the expression of a gene of interest in host microbes by adjusting the concentration of a small inducer molecule in the culture medium.

In this thesis, I investigate the adaptability of well-characterised E. coli inducer systems for use in new hosts, Pseudomonas putida (P. putida) and Bacillus subtilis (B. subtilis). Adaptation was done by introducing novel host-optimised promoters in place of native inducible systems promoters. The two promoters in each system were targets for optimisation. One promoter directs expression of the inducer sensor Transcription Factor (TF). The TF regulates transcription from the inducible promoter, which directs the expression of the reporter gene. These systems were targeted by the following six inducers: Vanillic acid (Van), Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), Cuminic acid (Cuma), 3,4-Dihydroxybenzoic acid (DHBA), Anhydrotetracycline hydrochloride (aTc) and l-Arabinose (Ara). Novel promoters were generated beforehand via the predictive power of a Transformer-based artificial intelligence deep learning architecture. The adaptation efforts and induction results demonstrate varying levels of success.

Adaptation efforts for P. putida only resulted in increased induction outputs for the aTc-system when grown in 0.2 μM aTc, which did not transfer over to the 10-fold aTc concentration. When compared to E. coli data generated for this thesis, I found the IPTG- and Ara-systems directly compatible with P. putida without any optimisation. Adaptation efforts did not improve this pattern. The Van-, Cuma- and DHBA-systems did not exhibit compatibility “out-of-the-box” and adaptation efforts did not indicate improved induction in P. putida.

The Cuma-system was the only system tested for compatibility with B. subtilis. Specifically, the heterologous yfp had its cross-species functionality tested, by first cloning a B. subtilis gfp Cuma-system derivative. I developed constitutively active P43-derivatives of these inducible systems for the same purpose. Mutations in the reporter coding sequences and the absence of a likely critical auxiliary promoter sequence produced inconclusive compatibility results. I cloned a constitutively active Pveg-YFP-derivative, which did not produce fluorescence relative to negative control. This partly indicates the incompatibility of heterologous yfp in B. subtilis. I suggest cloning a homologous B. subtilis positive control system to generate stronger evidence of these findings.