Karakterisering av promotorsystemene AntR-pAnt og RhaSR-pRha for Pseudomonas fluorescens og effekten av antranilat på alginatproduksjonen

Abstract

Biopolymeren alginat har flere egenskaper som gjør den egnet til bruk i flere forskjellige industrier. Alginat består av to monomerer, mannuronsyre og guluronsyre. Det er sammensetningen av disse bestanddelene som bestemmer egenskapene til alginatet. Idag kommer mesteparten av alginat fra brunalger, men bakterier i familiene Pseudomonas og Azotobacter kan også produsere alginat. Det som er interessant ved alginatproduserende bakterier er at ved genteknologi er det mulighet for å bestemme sammensetningen av alginat som blir produsert. Promotorsystem blir benyttet i genteknologi til å kontrollere transkripsjon av gen eller operon. I denne oppgaven har det blitt undersøkt hvordan to ulike promotorsystem, AntR-pAnt og RhaSR-pRha, kan regulere genekspresjon i den alginatproduserende bakterien P. fluorescens SBW25. Disse promotorsystemene skal undersøkes fordi de har blitt rapportert til å gi lite uindusert og relativt høyt indusert ekspresjon. AntR-pAnt bruker antranilat som induser, og studier har vist at antranilat påvirker biofilmproduksjonen i P. aeruginosa. Dette er interessant da alginat er en del av biofilmen til pseudomonader. Regulering av genekspresjonen skulle undersøkes ved å klone disse systemene inn i en ekspresjonsvektor med reportergenet, mCherry, som vil produsere rødt-fluorescerende protein (RFP). RFP kan måles ved fluorescens og dermed kan genekspresjonen måles. Deretter skulle flere dyrkingsforsøk gjennomføres, der ulike induserkonsentrasjoner og ulike induksjonstidspunkt skulle testes for å se hvordan det påvirket genekspresjonen. Resultatene viste at det beste induksjonstidspunktet for begge systemene var etter 11 timer og for det antranilat induserte systemet kunne genekspresjonen reguleres, men i det rhamnose induserte systemet ble det aktivert eller ikke. For regulering av genekspresjonen i P. fluorescens SBW25 kan promotorsytemene ha ulike bruksområder. Hvis målet er å aktivere promotorsystemet er Rha-pRha det beste promotorsystemet, da det holder seg på og rhamnose påvirker ikke veksten til P. fluorescens sammenlignet med antranilat som vil gi lavere vekstrate. Hvis genekspresjonen skal reguleres og holdes stabilt er det mer hensiktmessig å bruke AntR-pAnt promotorsystemet, da det ser ut som ekspresjonen kan reguleres bedre på ulike nivåer ved å bruke ulike induserkonsentrasjoner. Når det gjelder hvilket av promotorsystemene er mest strengt regulert, er begge strengt regulert fram til stasjonærfasen. RhaSR-pRha systemet lekker i stasjonærfasen og AntR-pAnt vil gjennomgå autoinduksjon.

Det ble også testet hvordan AntR-pAnt promotorsystemet påvirket produksjonen av alginat, i den alginatproduserende mutanten. P. fluorescens SBW25 mucA ved et alginatassay. Resultatene viste at antranilat påvirket produksjonen av alginat negativt, da mengden alginat ble mindre etter tilsats av antranilat.

Alginate is a biopolymer that possess several properties that make them suitable for application in various industries. Alginate is comprised of two monomers, mannuronic acid, and guluronic acid, with the composition of these components determining the material's characteristics. While the primary source of alginate is currently brown algae, bacteria from the Pseudomonas and Azotobacter families can also produce alginate. Notably, genetic engineering offers the potential to control the composition of alginate produced by these bacteria, utilizing promoter systems to regulate gene or operon transcription. This study investigates how two different promoter systems, AntR-pAnt and RhaSR-pRha, can modulate gene expression in the alginate-producing bacterium P. fluorescens SBW25. These promoter systems are of interest due to their reported ability to provide low levels of uninduced expression and relatively high levels of induced expression. AntR-pAnt utilizes anthranilate as an inducer, and previous studies have indicated anthranilate will impact the biofilm production in P. aeruginosa. This is noteworthy as alginate is a component of pseudomonad biofilms.

The regulation of gene expression was examined by cloning these systems into an expression vector with the reporter gene mCherry, generating red-fluorescent protein (RFP). Measurement of RFP fluorescence enabled the assessment of gene expression. Subsequent cultivation experiments were conducted, testing various inducer concentrations and induction time points to observe their effects on gene expression. Results revealed that the optimal induction time for both systems was after 11 hours. While gene expression could be regulated in the anthranilate-induced system, the rhamnose-induced system either activated or remained inactive.

Both promoter systems offer different applications in P. fluorescens SBW25. If the goal is to activate the promoter system, Rha-pRha is the preferred choice, as it remains active, and rhamnose does not affect the growth of P. fluorescens compared to anthranilate, which results in a lower growth rate. For regulated and stable gene expression, the AntR-pAnt promoter system is more suitable, as it appears to allow better regulation at different levels through varying inducer concentrations. Regarding the level of regulation, both promoter systems exhibit tight regulation until the stationary phase. The RhaSR-pRha system leaks in the stationary phase, while the AntR-pAnt undergoes autoinduction.

The study also explored how the AntR-pAnt promoter system affected alginate production in the alginate-producing mutant P. fluorescens SBW25 mucA using an alginate assay. Results indicated that anthranilate negatively impacted alginate production, leading to a decrease in the amount of alginate after anthranilate addition.