Morfologisk undersøkelse og genekspresjonsanalyse av HSP70, p38 og SOD1 i RTgill-W1 ved eksponering for kobber in vitro

Abstract

Kobber brukes som veksthemmende behandling i oppdrettsnæringen og har vist seg å ha negative effekter på fisk, men lite er fortsatt kjent om hvordan det påvirker oppdrettsfisk over tid. For å få en indikasjon på hvordan fisk påvirkes ved kobbereksponering kan man bruke in vitro stressforsøk, der man ser på endring i ekspresjon av stressrelaterte gener. Denne studien er en del av NFR-prosjektet "Bruk av kobberimpregnerte nøter i fiskeoppdrettsnæringen - konsekvenser for fiskehelse, bærekraft og produktivitet" (prosjektnummer 325849).

Gjelleceller fra voksen regnbueørret (RTgill-W1) ble eksponert for CuSO4⋅5H2O til endelige konsentrasjoner på 1,5 μg/l, 10 μg/l, 40 μg/l og 80 μg/l Cu over 4, 8 og 12 dager. RT-qPCR ble brukt som analysemetode med HSP70, p38 og SOD1 som målgener, og EF1α og EF1β som referansegener. Den relative genekspresjonen ble regnet ut ved hjelp av ΔΔCt-metoden der endring i genuttrykk er vist ved log2-normalisering av 2^-ΔΔCt. Det ble også gjort morfologiske undersøkelser under kobbereksponeringen for å undersøke fysiske endringer i cellene.

Ingen av biomarkørene viste en sammenhengende trend i hvilke tidsintervall eller konsentrasjoner som førte til opp- eller nedregulering. HSP70 var oppregulert ved dag 4-80 μg/l og dag 8-80 μg/l, og var nedregulert i resterende prøver. p38 var oppregulert ved alle tidsintervall, men viste en nedregulering i de laveste konsentrasjonene ved dag 4. SOD1 var nedregulert ved alle tidsintervall og konsentrasjoner. Det ble også observert endringer i morfologi, hvor det ble registrert mange løse, spisse og raspete celler. Dette kan indikere at kobber har hatt en påvirkning på morfologien til cellene.

Hensikten med forsøket var å se på i hvilken grad ulike konsentrasjoner av kobber vil indusere en stressrespons i cellene ved tidsintervall på 4, 8 og 12 dager. På bakgrunn av de morfologiske observasjonene og resultatene fra genekspresjonsanalysen har kobber vist seg å indusere en stressrespons på RTgill-W1-celler. Utslag på kvalitetskontroller og mangel på statistisk signifikans gjør at vi ikke kan validere resultatene fra analysen eller si noe om hvor omfattende stressresponsen har vært. Studien legger likevel et godt grunnlag for videre forskning på temaet, noe som vil gi økt kunnskap for å sikre god dyrevelferd i norsk oppdrettsnæring.

In the fish farming industry, copper is used as an antifouling agent, which have shown negative effects on fish. However, there is a lack of research on effects on farmed fish over time. In order to get an indication of how fish are affected by copper exposure, in vitro stress analysis can be used to observe changes in expression of stress-related genes. This study is part of the NFR project "Effects of antifouling copper coating in aquaculture - implications for fish health, performance and sustainability of production" (project number 325849).

Gill cells from adult rainbow trout (RTgill-W1) were exposed to copper as CuSO4⋅5H2O with Cu concentrations of 1,5 μg/l, 10 μg/l, 40 μg/l and 80 μg/l over 4, 8 and 12 days. RT-qPCR was carried out using HSP70, p38 and SOD1 as target genes, with EF1α and EF1β as reference genes. The relative gene expression was calculated using the ΔΔCt method where changes in gene expression are shown by log2 transformation of 2^-ΔΔCt. Cell morphology was also studied during the copper exposure to investigate physical changes in the cells.

None of the biomarkers showed any trend regarding which time intervals or concentrations lead to changes in gene expression. HSP70 was upregulated at day 4-80 μg/l and day 8-80 μg/l, while the rest of the samples were downregulated. p38 was upregulated in all time intervals, but showed a downregulation in the lowest concentrations at day 4. SOD1 was downregulated in all samples. Some changes in cell morphology were observed, with loose, sharp and raspy cells. This may indicate that copper had an effect on the morphology of the cells.

The purpose of this experiment was to find to what extent different copper concentrations induced a stress-related response in time intervals of 4, 8 and 12 days. Based on the morphological observations and the results from the expression analysis, copper has shown to induce a stress response in RTgill-W1 cells. Due to amplification in the quality controls and lack of statistic significance, the results of the analysis cannot be validated nor give any indication as how comprehensive the stressresponse has been. The results from this study serves as a foundation for further research, which will provide more knowledge to secure animal welfare in the Norwegian fish farming industry.