Species diversity and antibiotic resistance in Aeromonas spp. from aquatic environments

Abstract

Antimikrobiell resistens utgjør en trussel mot global helse, miljø og matsikkerhet. Medlemmer av slekten Aeromonas har blitt et fokus for studier av antimikrobiell resistens å grunn av deres rolle som reservoarer for antibiotikaresistensgener. De har mangefasetterte roller innenfor Èn-helse tilnærmingen, og er derfor sentrale i forskningen for å forstå og begrense spredningen av antimikrobiell resistens.

Hovedmålet med denne studien var å karakterisere 92 Aeromonas-isolater på artsnivå, teste dem for antibiotikaresistens og undersøke deres rolle som donorer i konjugasjon. Artsidentifisering ble utført ved hjelp av sekvensering av gyrB- og rpoD-gener, fenotypisk resistens ble testet ved hjelp av en diskdiffusjonstest med et panel på 16 antibiotika, genotypisk resistens ble analysert ved hjelp av ti helgenomsekvenser, og en konjugasjonsprotokoll ble brukt for å vurdere Aeromonas’ evne til å donere plasmider med cefotaxim (CTX) resistens.

Totalt ble 82 Aeromonas-isolater identifisert på artsnivå innenfor 12 forskjellige arter. Sammenkoblingen av rpoD- og gyrB-gensekvenser førte til identifisering av de fleste Aeromonas-isolatene på artsnivå og var bedre i stand til å skille klart relaterte arter enn ved bruk av bare ett av genene. Dette ble demonstrert ved at den klarte å skille mellom artene A. allosaccharophila og A. veronii. Ved testing av fenotypisk resistens ved hjelp av diskdiffusjonsmetoden, viste det seg at 88% av isolatene var resistente mot Ampicillin. Resistens ble også observert mot alle typer antibiotika som ble brukt, bortsett fra Tigecyklin. Av de 92 isolatene, ble 32 klassifisert som MDR-bakterier. Analyse av genotypisk resistens av ti helgenomsekvenser identifiserte ingen plasmider, men ulike mobile genetiske elementer som innsettingssekvenser fra Aeromonas og antibiotikaresistensgener som kodet for ulike beta-laktamaser ble funnet. Konjugasjonsprotokollen var også vellykket, da den positive kontrollstammen (Escherichia coli NNIE3) overførte CTX-resistens til mottakerstammen (E. coli CV601). Ingen av Aeromonas-isolatene var i stand til å overføre CTX-resistens.

For å konkludere, var det mulig å identifisere Aeromonas-slekten på artsnivå ved å sammenkoble husholdningsgener, med unntak av svært nært beslektede arter. Det var svært høy og lik diversitet blant isolatenes kilder. Norske isolater viste resistens mot flere typer antibiotika sammenlignet med svenske isolater. Det var også en viss sammenheng mellom fenotypisk og genotypisk resistens, da det var mulig å koble fenotypisk ampicillin- og karbapenemresistens til funn av beta-laktamasegener. Siden ingen av Aeromonas-isolatene overførte resistens, er videre studier viktige for å forstå Aeromonas’ rolle som formidler av antibiotikaresistens.

Antimicrobial resistance has become a threat to global health, the environment, and food safety. Due to their potential as reservoirs of antibiotic resistance genes, members of the genus Aeromonas have become a focus for studies of antimicrobial resistance. Their multifaceted role in all aspects of the one health approach has led to their recognition as critical subjects in the research towards understanding and mitigating the spread of antimicrobial resistance.

This study aimed to characterize 92 Aeromonas isolates down to the species level, test their antibiotic susceptibility, and assess their role as antibiotic resistance gene reservoirs. This included Species identification using gyrB and rpoD gene sequencing, determining phenotypic resistance through disc diffusion with a panel of 16 antibiotics, analyzing genotypic resistance in a set of ten whole genome sequences, and the use of a novel conjugation protocol to evaluate Aeromonas as donors of plasmids with cefotaxime (CTX) resistance.

A total of 82 Aeromonas isolates were identified at the species level, revealing 12 different species. The concatenation of rpoD and gyrB gene sequences identified the Aeromonas isolates down to the species level and separated closely related species compared to using only one of the genes. This was supported by its ability to separate species A. allosaccharophila and A. veronii. Testing phenotypic antibiotic resistance using the disc diffusion method, showed that 88% of the isolates were resistant to Ampicillin. In addition, resistance was observed towards all antibiotics, except tigecycline. Of the 92 isolates, 32 were classified as Multidrug-Resistant (MDR) bacteria. Genotypic resistance analysis of ten whole genome sequences revealed no plasmids but various Mobile Genetic Elements (MGEs) including various Insertion elements (IS) with Aeromonas spp. origin and antibiotic resistance genes coding for beta-lactamases were identified. The conjugation protocol was successful as the positive control strain (Escherichia coli NNIE3) was able to transfer CTX resistance to the recipient strain E. coli CV601. However, none of the Aeromonas isolates were able to transfer CTX resistance.

To summarize, the concatenation of gyrB and rpoD, resulted in an accurate identification of members of Aeromonas at the species level while separating the most closely related species. Species diversity was generally high for all sources, with at least two species identified, even for sources with 5 or fewer isolates. Antibiotic resistance was more prevalent in Norwegian isolates. Phenotypic and genotypic resistances were cohesive, and it was possible to link phenotypic Ampicillin and carbapenem resistance to the presence of various beta-lactamase genes. Further research is needed to understand the role of Aeromonas in antibiotic resistance, as no Aeromonas isolates were observed to donate resistance.