| dc.description.abstract | Choroid plexus er et organ som produserer mesteparten av cerebrospinalvæsken (CSV) i kroppen. Denne væsken omslutter hjernen og demper mekaniske slag samtidig som den bidrar til naturlig sirkulering av næring og avfallstoffer. Den inneholder også viktige bioaktive molekyler kalt "nevromodulatorer" som regulerer nervecellesynapser for å påvirke adferd og mental tilstand.
Upublisert data fra mitt laboratorie antyder at choroid plexus sekrerer nevromodulatorer ut i CSV ved å uttrykke spesifikke gener, og at disse inkluderer det søvn-, angst- og sult-relaterte proteinet «nevropeptid Y» (NPY) og opioidhormon-forløperen proenkephalin (PENK). Selv om disse neuromodulatorene påvirker essensielle prosesser i hjernen er deres uttrykksmønstre og fullstendige funksjoner fortsatt uklare.
Moderne verktøy som genredigeringssystemet CRISPR-Cas9 lar oss nå studere spesifikke gener ved å skape målrettede mutasjoner i genomet hos modellorganismer. For eksempel, et Cas9-indusert DNA-brudd vil rekruttere ulike reparasjonsenzymer som kan utnyttes til å øke eller senke uttrykksnivået til et gen av interesse. Videre, ved å bruke genetiske teknikker som Cre-LoxP- eller Gal4-UAS-systemet, kan uttrykksendringene begrenses til spesifikke vev og/eller tidsmessig kontrollert. Sammen kan disse verktøyene avsløre viktig informasjon når du undersøker funksjonen til et gen.
Ved å bruke zebrafisk (Dano rerio) som modellorganisme har jeg i dette prosjektet utført flere genetiske eksperimenter for å studere choroid plexus og dens rolle i nevromodulering. Her beskriver jeg bruken av «GeneWeld» målrettet integrasjonsstrategi og CRISPR-mediert knock-out (KO) av npy i zebrafisk. qPCR-genotyping og junction PCR-analyse viste at jeg ikke lyktes i å generere målrettede genetiske innsettinger, men jeg etablerte reagenser som er i stand til å effektivt generere mutasjoner i npy. Videre presenterer jeg de første rapporterte zebrafiskene med målrettede mutasjoner i penkb-genet. I tillegg har jeg generert flere transgeniske zebrafisk til bruk i ulike Gal4-UAS-baserte uttrykksstudier ved hjelp av Tol2 transposonet. Til slutt rapporterer jeg vellykket ablasjon av choroid plexus epitelceller i zebrafisk-larver ved hjelp av nitroreductase-metronidazol-systemet. Samlet legger arbeidet mitt et grunnlag for å undersøke den nevromodulerende rollen til choroid plexus i fremtidige eksperimenter ved hjelp av transgene, knock-out og vevs-ablerte zebrafisk. | |
| dc.description.abstract | The choroid plexus is the main producer of cerebrospinal fluid (CSF) in the body. The CSF is a clear, water-based fluid that envelops the brain, cushioning it against mechanical impacts while circulating nutrients and removing metabolic waste products. It also contains important bio-active molecules called “neuromodulators” that act on neuron synapses to alter their activity, thus affecting psychiatric state. We hypothesize that the choroid plexus contributes to the CSF-neuromodulator population by expressing specific secretory genes, and unpublished data from my laboratory suggests that these genes include the sleep-, anxiety-, and feeding-associated neuropeptide Y-gene (npy) and the opioid-hormone-precursor proenkephalin-gene (penk). Yet, their expression patterns and overall consequence in both humans and zebrafish remain unclear.
Modern genetic tools such as the CRISPR-Cas9 gene-editing system now let us study specific genes by generation of mutant model organisms containing targeted mutations. For instance, CRISPR-Cas9-induced DNA breaks will recruit various repair machinery that can be exploited to disrupt or enhance gene expression. Furthermore, by employing techniques such as the Cre-LoxP- or Gal4-UAS-system, the expression alterations can be limited to specific tissues and/or temporally controlled. Together, these tools can provide key information when investigating gene function.
By using zebrafish (Dano rerio) as my model organism, I have in this project carried out several genetic experiments to study the choroid plexus-CSF neuromodulatory relationship. Here, I describe use of the GeneWeld targeted-integration strategy and CRISPR-mediated knock-out (KO) of npy. qPCR-genotyping and junction PCR analysis showed that I did not succeed in generating targeted genetic insertions, however, I did establish reagents capable of efficiently generating disruptive mutations in npy. In addition, I present the first reported zebrafish with targeted mutations in the penkb gene. Furthermore, by using Tol2 transgenesis, I have generated multiple transgenic zebrafish for use in various Gal4-UAS-based expression studies. Last, I report successful ablation of choroid plexus epithelial cells in larval zebrafish using the nitroreductase-metronidazole system. Taken together, my work lays a foundation for investigating the neuromodulatory role of the zebrafish choroid plexus in future experiments using my transgenic, knock-out, and tissue-ablated fish. | |