Etablering av real-time PCR-metoder for påvisning og differensiering av Mycobacterium abscessus complex subspecies ved bruk av molekylære beacon-prober

Abstract

Mycobacterium abscessus complex er et bakteriekompleks som omfatter tre subspecies; Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium abscessus subsp. massiliense og Mycobacterium abscessus subsp. bolletii. Dette bakteriekomplekset er opportunistisk og kan gi alvorlig infeksjon i flere organer i kroppen. Ved Avdeling for Medisinsk Mikrobiologi på St. Olavs hospital finnes det per i dag ingen real-time PCR-metoder for å påvise og differensiere subspeciene. Hensikten med oppgaven var dermed å undersøke muligheten for å utvikle real-time PCR-metoder for påvisning og differensiering av subspeciene til Mycobacterium abscessus complex ved bruk av molekylære beacon-prober. Etablering av nye effektive PCR-metoder vil spille en sentral rolle når det kommer til valg av behandling og hvor raskt en infisert pasient mottar behandlingen.

Under prosjektet ble utviklingen av en multiplex real-time PCR-metode (for påvisning av M. abscessus og M. massiliense) og en spesifikk real-time PCR-metode (for påvisning av M. bolletii) påstartet. Arbeidet som ble gjennomført ved utvikling av metodene var basert på artikkelen «A Molecular-Beacon-Based Multiplex Real-Time PCR Assay To Distinguish Mycobacterium abscessus Subspecies And Determine Macrolide Susceptibility» skrevet av Marras et al. (2021).

Det ble gjennomført metodeoptimalisering, effektivitetsanalyse og utprøving av deteksjonsgrense for metodene på tre kontrollstammer, en for hver av subspeciene. Det ble i tillegg gjennomført spesifisitetsanalyser på 43 bakterieisolat hentet fra pasientprøver. Resultatene indikerer at metodene har god spesifisitet og at metodenes effektivitet ligger like under kravene som er satt av laboratoriet til avdelingen for real-time PCR-metoder. Basert på undersøkelse av metodenes deteksjonsgrense kan ikke metodenes sensitivitet fastslås og må bestemmes ved å utføre ytterligere analyser.

Arbeidet som ble gjennomført under bachelorprosjektet indikerer at utviklingen av real-time PCR-metoder basert på molekylære beacon-prober for identifisering av Mycobacterium abscessus complex subspecies kan være en mulighet. Metodene må videreutvikles og valideres av Avdeling for Medisinsk Mikrobiologi til to fullverdige metoder før de kan benyttes i rutinen til sykehuslaboratoriet.

Mycobacterium abscessus complex is a bacterial complex comprising the three subspecies: Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium abscessus subsp. massiliense and Mycobacterium abscessus subsp. bolletii. The bacterial complex is opportunistic and can cause serious infection in several different organs in the body. At the Department of Medical Microbiology at St. Olav's Hospital, there are currently no real-time PCR methods for detecting and differentiating the subspecies. The purpose of the thesis was thus to investigate the possibility of developing real-time PCR methods for the detection and differentiation of the subspecies of Mycobacterium abscessus complex using molecular beacon probes. Establishment of new effective PCR methods will play a key role when it comes to the choice of treatment and how quickly an infected patient receives it.

During the project, the development of a multiplex real-time PCR method for the detection of M. abscessus and M. massiliense was started along with a specific real-time PCR method for the detection of M. bolletii. The work was based on the article «A Molecular-Beacon-Based Multiplex Real-Time PCR Assay To Distinguish Mycobacterium abscessus Subspecies And Determine Macrolide Susceptibility» by Marras et al. (2021).

Method optimization, efficiency analysis, and testing of the detection limits for the methods were performed on three control strains, one for each of the subspecies. In addition, specificity analyses were performed on 43 bacterial isolates obtained from patient samples. The results indicate that the methods have a good specificity, and that the efficiency of the methods is just below the requirements set by the laboratory for real-time PCR methods. Based on the testing of the detection limits of the methods, the sensitivity of the methods cannot be immediately determined and further analyses need to be carried out before a decision can be made.

The results obtained from this bachelor project indicate that the development of real-time PCR methods based on molecular beacon probes for the identification of Mycobacterium abscessus complex subspecies may be a possibility. The methods must be further developed and validated by the Department of Medical Microbiology before they can be used routinely in the hospital laboratory.