Identification and characterization of Listeria monocytogenes originating from the salmon processing value chain

Abstract

Identifiseringen, kildesporingen og overvåkningen av matbårne patogener som Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) er viktig for matproduksjonsindustrien for å hindre store utbrudd med alvorlige konsekvenser for menneskeliv. Flere teknikker har blitt utviklet innen stamme-differensiering, hvorav helgenom sekvensering (HGS) er den mest diskriminerende. HGS har derimot ikke blitt implementert på stor skala av matindustrien siden det krever den rette infrastrukturen, stor bioinformatisk ferdighet, og er en meget dyr metode for storskala studier. Dette har ledet til utviklingen av ønsket for en raskere, billigere og mer brukervennlig differensieringsmetode. En metode kombinerer klassisk Rep-PCR med Oxford Nanopore sekvensering (ON-rep-seq) har nylig blitt utviklet. I denne studien demonstrerer vi evnen til ON-rep-seq metoden til å differensiere isolater av L. monocytogenes ned til stammenivå med en sensitivitet som er målbar med HGS. Totalt ble 160 prøver fra fillet avdelingen fra et lakseslakteri analysert med ON-rep-seq, som påviste et lavt nivå av genetisk mangfold blant fillet avdeling isolatene. Basert på ON-rep-seq reultatene ble 10 isolater sent avgårde for videre karakterisering med HGS. Den genomiske dataen fra HGS analysen viser et forhold mellom "lengt count profile" (LCp) plot morfologi fra ON-rep-seq, og sekvenstyper (ST) fra Multi Locus Sequence Typing (MLST) analyse. Tre ulike ST ble observert i fillet avdelingen, ST37 (n = 7), ST8 (n = 2) og ST637 (n = 1). For å utvide kolleksjonen av isolater ble seks isolater fra slakteriets egen kvalitetskontroll avdeling samt seks ST8 isolater fra tidligere i lakseproduksjonens verdikjede undersøkt av TraceListeria prosjektet inkludert. Fem av kvalitetskontroll isolatene ble karakterisert som ST37 og den siste som ST8. En fylogenetisk analyse av høykvalitet enkeltnukleotidpolymorfisme (hqSNPs) ble også utført og samlet isolatene i grupper som korresponderte med deres ST. Isolatene ble også utsatt for en variasjon av in vitro karakteriseringsanalyser som antimikrobiell sensitivitet, kuldetoleranse, salt toleranse og syretoleranse. De fenotypiske resultatene ble sammenlignet med HGS dataen. Antimikrobielle sensitivitets analysen avdekket nesten ingen resistens mot syv antibiotikum, med unntak av cefoxitin som L. monocytogenes har en iboende resistens mot. HGS dataen støtter disse observasjonene. Ingen forhold mellom ST og økt, eller minket toleranse mot noen av stress faktorene kunne avdekkes.

The identification, source tracking and surveillance of foodborne pathogens such as Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) are crucial for the food industry to limit major outbreaks with severe consequence of human life. Several techniques within strain-level differentiation of pathogens have been developed, with whole-genome sequencing (WGS) being the most discriminatory. However, WGS has not been implemented in large by the food industry as it requires the right infrastructure, high bioinformatical skill and is a very expensive method for large scale studies. The need for a faster, cheaper, and more user-friendly method has been developed. A method combining classic Rep-PCR with Oxford Nanopore sequencing (ON-rep-seq) has been developed recently. In this study, we demonstrate the ability of the ON-rep-seq assay to differentiate isolates of L. monocytogenes down to the strain level with a sensitivity comparable with that of WGS. In total 160 isolates from the filleting department of a salmon processing plant were analyzed using ON-rep-seq which showed a low level of genetic diversity among filleting department isolates. Based on ON-rep-seq results, 10 isolates were sent off for further characterization with WGS. The genomic data from the WGS assay shows a relationship between length count profile (LCp) plot morphology, obtained from ON-rep-seq, with sequence types (STs) obtained through Multi Locus Sequence Typing (MLST). Three different STs were observed in the filleting department, ST37 (n = 7), ST8 (n = 2) and ST637 (n = 1). To expand the collection of isolates, six isolates from the processing plant’s own quality control team were included as well as all six ST8 isolates obtained earlier in the value chain examined by the TraceListeria project. Five of the quality control isolates were characterized as ST37 and the last as ST8. A phylogenetic analysis of high-quality single nucleotide polymorphisms (hqSNPs) was also performed which clustered isolates into groups corresponding to their STs. The isolates were also exposed to a variety of in vitro characterization assays such as antimicrobial susceptibility, cold tolerance, salt tolerance and acid tolerance. The phenotypic results were compared to WGS data. The antimicrobial susceptibility assay displayed almost no resistance to seven of the antibiotics tested, with the exception of cefoxitin to which L. monocytogenes is innately resistant. The WGS data supports these observations. The isolates’ growth was not inhibited when exposed to cold, salt or acid, but somewhat limited. No relationship between ST and increased or decreased tolerance to these stress factors could be discerned.