Forbedret tularemidiagnostikk med real-time PCR for Francisella tularensis

Abstract

Francisella tularensis er en bakterie som kan føre til en potensielt alvorlig zoonose. Bakterien formerer seg effektivt i ulike vertsceller, og kan på denne måten infisere store deler av kroppen. Francisella tularensis er en kravstor bakterie, og kan derfor være vanskelig å få vekst av på dyrkingsmedier. Grunnet dette regnes Polymerase Chain Reaction (PCR) som en bedre deteksjonsmetode. Avdeling for medisinsk mikrobiologi, Seksjon diagnostikk ved St. Olavs Hospital ønsket å undersøke mulighetene for å etablere en mer sensitiv diagnostikk for påvisning av Francisella tularensis, sammenliknet med PCR-metoden avdelingen har benyttet i flere år. Dette ble gjort ved å undersøke nye sett med primere og prober, som var 4Pan1, B2 og ISFtu. Primere og prober ble valgt basert på tidligere forskning beskrevet i de publiserte artiklene «Differentiation of Francisella tularensis Subspecies and Subtypes» (1), og «Development of a Multitarget Real-Time TaqMan PCR Assay for Enhanced Detection of Francisella tularensis in Complex Specimens» (2).

Ulike Real-Time PCR-analyser av eksisterende metode, 4Pan1, B2 og ISFtu ble utført for å sammenlikne metodene og undersøke deres sensitivitet. Det ble utført analyse av effektivitet, gradient, optimalisering av primer og probe, og spesifisitet. Dette for å optimalisere metodenes reaksjonsbetingelser og undersøke eventuelle interfererende bakteriearter. Videre ble analyse av Francisella-stammer, deteksjonsgrense og prøvemateriale utført for å avdekke en mulig tendens til bedre sensitivitet for enkelte metoder.

Resultatene viste god effektivitet og en annealingtemperatur på 55oC ble valgt for samtlige metoder. Det ble ved analyse av optimalisering av primer og probe valgt å benytte PCR-miks 5 for eksisterende metode og 4Pan1, og PCR-miks 9 for B2 og ISFtu. Videre viste resultatene god spesifisitet for alle metodene. Det ble utført analyse av ulike Francisella-stammer der resultatene viste at 4Pan1 og eksisterende metode detekterte underartene holarctica, tularensis, novicida og mediasiatica. ISFtu detekterte også disse, i tillegg til Francisella philomiragia. B2 påviste kun holarctica. Deteksjonsgrensen til ISFtu ble bestemt til <0,55 kopier av bakteriegenet per PCR-reaksjon. Analyse av prøvemateriale viste at ISFtu ga omtrent 4-5 lavere Ct-verdier enn de resterende metodene. Det ble konkludert med at ISFtu viste en tendens til bedre sensitivitet enn resterende metoder. Imidlertid er det nødvendig med videre arbeid før en ny metode kan implementeres ved avdelingen.

Francisella tularensis is a bacterium that can lead to a potentially serious zoonosis. The bacterium multiplies efficiently in various host cells and can in this way infect large parts of the body. Francisella tularensis is a demanding bacterium and can accordingly be difficult to grow on culture media. Polymerase Chain Reaction (PCR) is therefore considered as a better detection method. Department of Medical Microbiology, Section Diagnostics at St. Olav's Hospital wanted to investigate the possibilities of establishing a more sensitive diagnostics for the detection of Francisella tularensis, compared to the PCR method currently in use. This was done by examining new sets of primers and probes, which were 4Pan1, B2 and ISFtu. Primers and probes were selected based on previous research described in the published articles "Differentiation of Francisella tularensis Subspecies and Subtypes" (1), and "Development of a Multitarget Real-Time TaqMan PCR Assay for Enhanced Detection of Francisella tularensis in Complex Specimens" (2).

Various Real-Time PCR analyses of existing method, 4Pan1, B2 and ISFtu were carried out to compare the methods and examine their sensitivity. Analysis of efficiency, gradient, primer and probe optimization, and specificity were performed. The purpose of this was to optimize the reaction conditions of the methods and investigate eventually interfering bacterial species. Furthermore, analysis of Francisella strains, detection limit and sample material were performed to investigate a possible tendency for better sensitivity for certain methods.

The results showed good efficiency and an annealing temperature of 55oC was chosen for all methods. When analyzing primer and probe optimization, PCR mix 5 was chosen for existing method and 4Pan1, and PCR mix 9 for B2 and ISFtu. Furthermore, the results showed good specificity for all methods. Analysis of various Francisella strains was performed where the results showed that 4Pan1 and existing method detected the subspecies holarctica, tularensis, novicida and mediasiatica. ISFtu also detected these, in addition to Francisella philomiragia. B2 detected only holarctica. The limit of detection of ISFtu was determined to be <0.55 copies of the bacterial gene per PCR reaction. Analysis of sample material showed that ISFtu gave approximately 4-5 Ct values lower than the remaining methods. It was concluded that ISFtu showed a tendency for better sensitivity than the remaining methods. Further work is needed before a new method can be implemented at the department.