Physiological and Metabolic Consequences of Expression Vector Presence in Escherichia coli

Abstract

Escherichia coli er en av de mest brukte vertsorganismene for rekombinant proteinproduksjon, selv om bakterien har ulemper som kan redusere proteinutbytte. Ekspresjonsvektorer kan påføre produksjonsorganismen en metabolsk byrde, som kan føre til fysiologiske og metabolske konsekvenser. Disse konsekvensene kompliserer utviklingen og optimaliseringen av rekombinante bioprosesser. Den metabolske byrden ekspresjonsvektorer påfører produksjonsorganismen ble studert ved hjelp av rekombinant E. coli BL21 transformert med ekspresjonsvektorer med to forskjellige styrker av det induserbare XylS/Pm ekspresjonssystemet og to variasjoner i plasmidkopinumre. For de ulike kombinasjonene av ekspresjonsvektorstyrkene og plasmidkopinumrene studert var det en stamme som produserte reporterprotein mCherry og en kontrollstamme som manglet det mCherry-kodende genet. Batch kultiveringer i labskala bioreaktorer ble utført for å studere vekstegenskapene til de ulike stammene. Den ekstracellulære konsentrasjonen av substrat og produkter gjennom kultiveringen ble kvantifisert ved hjelp av høypresisjonsvæskekromatografi. Revers fase væskekromatografi-tandem massespektrometri ble brukt til å kvantifisere den intracellulære konsentrasjonen av aminosyrer og TCA syklus metabolitter for å studere hvordan ekspresjonsvektorene påvirket de intracellulære konsentrasjonene av metabolittene. Mikroskopering ble brukt til å sammenligne de cellulære lengdene mellom de ulike stammene.

Resultatene demonstrerte at den metabolske byrden ekspresjonsvektorene påførte vertsorganismen førte til fysiologiske og metabolske konsekvenser. Det ble observert at den teoretiske mengden metabolsk byrde implisert av økende plasmidkopitall, styrke på ekspresjonssystemet og produksjon av reporterproteinet mCherry ble gjenspeilet i graden av fysiologiske og metabolske konsekvenser. De rekombinante stammene transformert med ekspresjonsvektorer med høy grad av teoretisk byrde hadde signifikant mer reduserte veksthastigheter og økt produksjon av overstrømningsmetabolitter etter induksjon sammenlignet med de andre stammene. Stammen som var transformert med ekspresjonsvektoren som hadde høyest grad av teoretisk metabolsk byrde ble observert til å ha høyest grad av fysiologiske og metabolske konsekvenser. Stammen hadde fullstendig vekststopp etter indusering av mCherry produksjon, redusert biomassekonsentrasjon, større grad av filamentøse celler, tilpasning av metabolismen mot energi produserende reaksjonsspor, og økte ekstracellulær konsentrasjon av overstrømmingsmetabolittene eddiksyre og melkesyre.

Escherichia coli is one of the most commonly used hosts for recombinant protein production, although the bacterium has some drawbacks that can negatively impact protein yields. Expression vectors place a metabolic burden on the host, leading to physiological and metabolic consequences. These consequences complicate the development and optimization of recombinant protein production processes. The metabolic burden on the host caused by expression vectors presence was studied using recombinant E. coli BL21 transformed with expression vectors with two different strengths of the inducible XylS/Pm expression system and two variations in the plasmid copy numbers. For the different combinations of expression system strength and plasmid copy number studied, there was one strain expressing the reporter protein mCherry and a negative control strain lacking the mCherry encoding gene. Batch cultivations in bench-scale bioreactors were performed to study the growth characteristics of the different strains. The extracellular concentration of substrates and products throughout the cultivations were quantified using high-performance liquid chromatography. Reverse phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to quantify the intracellular concentrations of amino acids and TCA cycle intermediates to investigate how the expression vectors affected the intracellular pools of these metabolites. Finally, microscopy was used to compare cellular lengths between the different strains.

The results demonstrated that the metabolic burden expression vectors placed on the host lead to physiological and metabolic consequences. It was observed that the theoretical degree of metabolic burden implied by increased plasmid copy number, expression system strength, and expression of the reporter protein mCherry, was reflected in the severity of these consequences. The recombinant strains transformed with expression vectors having a higher theoretical degree of metabolic burden had a significantly greater reduction in growth rate after induction and increased secretion of overflow metabolites compared to the other strains. The strain harboring the expression vector with the highest degree of theoretical metabolic burden was observed to have the most severe physiological and metabolic consequences. The strain had complete growth inhibition after induction of mCherry expression, decreased biomass formation, increased cell filamentation, an adaption of the central carbon metabolism towards energy-generating pathways, and increased secretion of the overflow metabolites acetic acid and lactic acid.