Homologous recombination with oroP-cassette as a counter-selection tool for deletion of folD in Bacillus subtilis

Abstract

I denne studien ble det utført en homolog rekombinasjon med en oroP-kasett som et motselektivt verktøy for å fjerne genet folD i bakterien Bacillus subtilis (B. subtilis). Et BLAST-søk gjennomført i tidligere studier avdekket folD i B. Subtilis. Dette genet koder for enzymet metylentetrahydrofolate dehydrogenase. Metylentetrahydrofolat dehydrogenase er involvert i tetrahydrofolat-avhengig formaldehyd avgiftningspor i Methylorubrum extorquens AM1. Det ble derfor antatt at folD er avgjørende for dissimilering av formaldehyd i B. Subtilis. Videre kan en delesjon av dette genet i bakterien føre til et skifte fra dissimulering til assimilering av formaldehyd i cellene. I nærvær av formaldehyd, kan dette øke methylotrofisk vekst i B. subtilis. Denne antagelsen kunne ikke bekreftes på grunn av tidsbegrensninger og bør derfor testes i fremtidige studier.

Ut ifra denne studien var det ikke mulig å bekrefte en vellykket delesjon av folD i B. subtilis 168 ved bruk av homologous rekombinasjon med oroP-kasett som motselektivt verktøy. Resultatene av delesjonen var tvetydige og en sekvsensering av B. subtilis 168 kolonier med vekst på mot-selektiv forbindelsen, 5-FU, er nødvendig for å bekrefte eller avkrefte delesjonen. Imidlertid ble konstruksjonen av oroP-kassetten og innsettingen av denne kassetten i B. Subtilis 168 vellykket verfisert.

In this study, a homologous recombination with oroP-cassette as a counter-selective tool for deletion of the folD in Bacillus subtilis (B. subtilis) was carried out. A BLAST- search conducted by earlier research revealed that folD, coding for methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, was found in B. subtilis. The enzyme, methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, is involved in the tetrahydrofolate-dependent formaldehyde detoxification pathway in Methylorubrum extorquens AM1. Hence, it was assumed that folD is vital for the dissimilation of formaldehyde in B. subtilis, and a deletion may cause a shift of formaldehyde dissimilation to assimilation of formaldehyde in the cells. In the presence of formaldehyde, this might enhance methylotrophic growth of B. subtilis. This assumption could not be confirmed due to time limitations and therefore should be tested in future experiments.

Based on this study, it was not possible to confirm a successful deletion of folD into B. subtilis 168 using homologous recombination with oroP-cassette as a counter-selective tool. The results of the deletion were ambiguous and a future sequencing of B. subtilis 168 colonies with growth on the counter-selective medium, 5-FU, is necessary to confirm or exclude a clean deletion. However, the construction of the oroP-cassette and the insertion of this cassette into B. subtilis 168 were positively verified.