Fluorescent Ligands for Detection of Transthyretin Amyloid - Photophysics and Cytotoxicity on Astrocytes

Abstract

Når proteiner feilfoldes og danner uoppløselige avleiringer får man amyloidfibriller. Sykdommer som forårsakes av disse proteinaggregatene kalles for amyloidose. Når transportproteinet transthyretin (TTR) danner amyloidfibriller (ATTR) kan alvorlige sykdommer forekomme. Eksempler er familiær amyloid polynevropati (FAP) og senil systemisk amyloidose (SSA). Det finnes få behandlingsmuligheter, og for å lykkes med behandling må sykdommen oppdages så tidlig i sykdomsforløpet at pasienten enda ikke har utviklet symptomer. Derfor er det viktig å utvikle metoder for tidlig deteksjon av ATTR.

Det har blitt utført spektroskopiske målinger for å karakterisere fotofysiske egenskaper til ligandene BTD-17 og BTD-21, og for å undersøke hvor egnet ligandene BTD-17, pFTAA og X34 er til å detektere ATTR. I tillegg har bindingsstedene til disse fluoroforene på ATTR blitt utforsket ved å se på Förster resonansenergioverføring (FRET). Og ettersom TTR kan forårsake alvorlige sykdommer har det blitt utført overlevelseseksperimenter med ATTR og astrocytter (hjelpeceller i hjernen) fra rotter. Laser scanning konfokalmikroskopi (CLSM) ble brukt for å avbilde ATTR og astrocytter, hver for seg og kombinert. Dette ble gjort for å undersøke morfologien til amyloidfibrillene og for å studere plasseringen av ATTR i forhold til celler.

Ved å ta for seg endringer i fluorescenceintensitet og -levetid for ligander som binder til ATTR virker BTD-17 som den best egnede til å skille prøver med ATTR fra prøver med kun løsnignsmiddel og ligand. Resultater fra FRET-målinger, der tryptofan (Trp) blir brukt som donor, viser at alle ligandene binder nært til Trp, og forårsaker FRET-effekt. Ingen av ligandene viser giftige trekk når de tilføres astrocytter, noe som gjør dem egnet for fremtidige cellestudier. På den andre siden påvirker ATTR celleoverlevelsen noe negativt. Ved å bruke BTD-17 og pFTAA til å farge ATTR i pH 2- og pH 7-buffere avsløres det at ATTR har polymorfe trekk. Mens BTD-17 ser ut til å binde sterkt til fibriller ved pH 2, binder pFTAA til filamenter, som opptrer i begge bufferene.

Amyloidosis are diseases caused by proteins misfolding into insoluble variants called amyloid fibrils. They can form aggregates and cause diseases characterized by high morbidity. When the transport protein transthyretin (TTR) accumulates and forms amyloid fibrils (ATTR), serious diseases such as familial amyloid polyneruopathies (FAPs) and senile systemic amyloidosis (SSA) can occur. Treatment is limited, but to succeed, the disease must be detected early, even before a person gets symptoms. Therefore, development of methods for early detection of amyloid transthyretin is of great importance.

Spectroscopic measurements are performed to characterize photophysical properties of the ligands BTD-17 and BTD-21. The suitability of the probes BTD-17, pFTAA and X34 for detection of ATTR is examined, as well as the ligand binding sites on ATTR by addressing Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Since amyloid TTR give rise to diseases, toxicity of ATTR to rat brain helper cells (astrocytes) is investigated to learn more about the pathogenicity of these fibrils. Finally, confocal laser scanning microscopy (CLSM) is used to image ligand stained ATTR and astrocytes, separately and combined, to reveal the transthyretin amyloid morphology and to examine the localization of ATTR relative to cells.

By addressing both changes in fluorescence intensity and decay for ligands upon binding to ATTR, BTD-17 seems to be the most suited ligand for discrimination between probe dissolved in buffer with and without ATTR. By performing FRET measurements, using Trp in ATTR as FRET donor, all the ligands seem to bind tight to Trp and cause FRET effects. Neither of the ligands show toxic traits when administered to astrocytes, allowing them to be used for future cell studies. ATTR, on the other hand, show to have a weak negative impact on astrocyte viability. By using both BTD-17 and pFTAA to label ATTR in pH 2 and pH 7 buffers, polymorphic traits of ATTR are revealed. BTD-17 seem to bind strongly to fibrils at pH 2, while pFTAA seem to interact strongly with filaments, which are present in both buffers.