A structural and functional study of AlgE mannuronan C5-epimerases and lyases from Azotobacter vinelandii and Azotobacter chroococcum

Abstract

Alginat er lineære, anioniske polysakkarider, som består av (1→4) bundet β-D-mannuron- syre (M) og α-L-guluronsyre (G). Hvert polysakkarid syntetiseres først som mannuronan og G-enheter introduseres av mannuronan C5-epimeraser i etterkant. Deler av alginat som inneholder mye guluronsyre danner kryssbindinger med hverandre når de koordineres med divalent kationer. Dette forårsaker dannelsen av stabile og biokompatible geler. Alginat har derfor blitt en industrielt viktig biopolymer, som benyttes innen flere ulike felt inkludert matindustrien og farmasøytisk industri.

Ytterligere modifiseringer av alginat katalyseres av flere typer enzymer. En gruppe med slike enzymer er alginatlyasene, som kløyver alginatmolekylene ved β-eliminering. Det tenkes at alginatlyasene og mannuronan C5-epimerasene har en delvis felles reaksjonsmekanisme, som skilles i det siste steget. I dette steget blir et proton fjernet fra C5 og doneres enten tilbake til C5 på motsatt side av sukkerringen, som forårsaker epimerisering, eller til glykosidbåndet, som forårsaker kløyving. Ti kalsiumavhengige, ekstracellulære AlgE-type mannuronan C5-epimeraser (AlgE-epimeraser) har blitt oppdaget i alginatproduserende stammer av Azotobacter og flere av dem viser lyaseaktivitet i tillegg til å være epimeraser. Dette styrker teorien om at reaksjonsmekanismen til lyase- og epimerasereaksjoner på polysakkarider har noen felles steg. Det er også kjent at AlgE-epimerasene fra Azotobacter virker godt in vitro, som gjør dem til potensielle verktøy for å designe alginater av høy renhet med spesifikke applikasjoner innenfor felt som bioteknologi og farmasi.

Hensikten med dette prosjektet var å fortsette undersøkelsen av AlgE-epimerasene fra Azotobacter, spesielt den bifunksjonelle epimerase/lyase aktiviteten som noen av dem har. Prosjektet ble utført i to deler. Den første delen var å fortsette den biokjemiske karakteriseringen av de tre AlgE-epimerasene fra A. chroococcum kalt AcAlgE1, AcAlgE2 og AcAlgE3. De ble nylig produsert i E. coli for første gang og de to sistnevnte viste lyaseaktivitet. Den andre delen av prosjektet besto av å konstruere mutanter av A. vinelandii algE6 med bestemte nukleotider fra A. vinelandii algE7. Proteinproduktene deres ble testet for lyaseaktivitet, siden AlgE7 også er kjent for å ha bifunksjonell epimerase/lyase aktivitet.

Analysen av de tre enzymene fra A. chroococcum viste at AcAlgE1 er en effektiv epimerase, som ikke uttrykker lyaseaktivitet. Enzymet foretrekker å epimerisere monomerer som allerede sitter ved siden av en G og begynner produksjonen av G-blokker nesten med en gang. Enzymets produkt ser ut til å inneholde hovedsakelig G-blokker. AcAlgE2 og AcAlgE3 utrykker bifunksjonell epimerase/lyaseaktivitet og epimerisering ser ut til å være den foretrukne reaksjonen på uepimerisert substrat. Deres foretrukne kløyvingsseter kan være M↓GM og/eller M↓MM. Lyase- og epimeraseaktiviteten til AcAlgE2 og AcAlgE3 ble undersøkt ved ulike betingelser ved å endre på pH og konsentrasjonen av NaCl og Ca2+. Noen av resultatene var tvetydige, men det kunne virke som at AcAlgE2 og AcAlgE3 er mer aktive ved surere og/eller mer basiske forhold. I tillegg stimulerte lave konsentrasjoner av NaCl både lyase- og epimeraseaktiviteten til AcAlgE2, men lyaseaktiviteten sank ved høyere konsentrasjoner enn 75 mM NaCl. Aktiviteten til både AcAlgE2 og AcAlgE3 økte ved tilsetning av Ca2+ opp til 3 mM Ca2+, men det var indikasjoner på lavere aktivitet når konsentrasjonen var høyere enn dette. Deres evne til å introdusere G-blokker ble også påvirket av mengden Ca2+ og NaCl som var tilstede. Høye mengder med Ca2+ inhiberte G-blokkdannelse for begge enzymene, mens økt G-blokkdannelse ble observert for AcAlgE2 ved høye mengder NaCl.

I den andre delen av dette prosjektet ble det konstruert åtte mutanter av algE6 for å undersøke om lyaseaktiviteten til AlgE7 kan introduseres i AlgE6 ved å gjøre deres primærsekvenser likere. Syv av algE6-mutantene inneholdt mutasjoner rundt det aktive setet til AlgE6 i aminosyrene på plass 148, 172 og 194. Den siste mutanten var et kimært gen av algE6 og algE7, som kombinerte kalsiumbindingssetet til AlgE7A med det aktive setet i AlgE6. Celleekstraktene fra algE6-mutantene ble testet for mulig lyaseaktivitet. Basert på de første testene, virket det ikke som at kalsiumbindingssetet til AlgE7A førte til lyaseaktivitet i AlgE6. Proteiner med aminosyreendringene G148R, D194G og G148R/D194G derimot, viste tegn til lyaseaktivitet i de første testene. De ble derfor renset for å fortsette undersøkelsen, som til slutt viste at disse mutasjonene ikke førte til lyaseaktivitet i AlgE6. Dette tilsier at aminosyrene i disse posisjonene ikke er alene om å forårsake bifunksjonaliteten til AlgE7. Celleekstraktene fra G148R/L172K-dobbelmutanten viste også tegn til lyaseaktivitet i de første testene, men ble ikke renset for nærmere undersøkelse i dette prosjektet.

Alginates are linear, anionic polysaccharides that consist of (1→4) linked β-D-mannuronate (M) and α-L-guluronate (G). Each polysaccharide is initially synthesized as mannuronan and G-residues are then introduced post-synthesis by mannuronan C5-epimerases. G-rich areas of the alginates form junctions when they coordinate with divalent cations, which causes the formation of stable and biocompatible gels. Alginate is therefore an industrially important biopolymer that is currently being used in various fields, such the food- and pharmaceutical industry.

Additional post-synthesis modifications of the alginates are catalyzed by several types of enzymes. One such group of enzymes are the alginate lyases that cleave the alginate molecules through β-elimination. The alginate lyases and the mannuronan C5-epimerases are thought to share a unified reaction mechanism that differs in the final step. In this step, a proton abstracted from C5 is either donated back to C5 at the opposite face of the sugar ring, causing epimerization, or to the glycosidic bond, causing cleavage. Ten calcium-dependent, extracellular AlgE-type mannuronan C5-epimerases (AlgEs) have been discovered in alginate-producing strains of Azotobacter and several of them exhibit alginate lyase activity in addition to epimerase activity. This strengthens the theory of a unified mechanism for the lyase and epimerase reactions. The AlgEs of Azotobacter are also known to work well in vitro, making them potential tools for designing high-purity alginates with specific applications in the fields of biotechnology and pharmaceuticals.

The aim of this project was to further the investigation of these AlgEs from Azotobacter, in particular the bifunctional epimerase/lyase activity that is exhibited by some of them. The project was carried out in two parts. The first part was to continue the biochemical characterisation of the three AlgEs from A. chroococcum called AcAlgE1, AcAlgE2 and AcAlgE3. They were recently produced recombinantly for the first time and the latter two were found to exhibit bifunctional epimerase/lyase activity. The second part consisted of constructing mutants of A. vinelandii algE6 with certain nucleotides from A. vinelandii algE7 and testing their protein products for lyase activity, since AlgE7 is also known to exhibit bifunctional epimerase/lyase activity.

The analyses of the three A. chroococcum enzymes showed that AcAlgE1 is an effective epimerase, exhibiting no lyase activity. The enzyme has a preference towards epimerizing next to pre-existing Gs and begins the introduction of G-blocks almost instantenously. Its product appears to be dominated by G-blocks. AcAlgE2 and AcAlgE3 exhibited bifunctional epimerase/lyase activity and epimerization appeared to be the preferred mode of action on an unepimerized substrate. Their preferred cut sites appeared to be M↓GM and/or M↓MM. The lyase and epimerase activities of AcAlgE2 and AcAlgE3 were observed under different environmental conditions by varying the pH value, as well as the concentrations of NaCl and Ca2+. Some of the results were inconclusive. However, they indicated that AcAlgE2 and AcAlgE3 are more active in somewhat acidic and/or alkaline environments. At lower concentrations, NaCl stimulated both the lyase and epimerase activity of AcAlgE2, while the lyase activity decreased at concentrations higher than 75 mM NaCl. The activities of both AcAlgE2 and AcAlgE3 were stimulated by Ca2+ up to about 3 mM Ca2+, but there were some indications of lower activity at high concentrations. Their ability to introduce G-blocks was also affected by the amount of Ca2+ and NaCl in the reaction. High amounts of Ca2+ inhibited the G-block formation catalyzed by AcAlgE2 and AcAlgE3, while AcAlgE2 was stimulated to produce G-blocks in the presence of high amounts of NaCl.

In the second part of this project, eight different mutants of algE6 were constructed in order to test if the lyase activity observed for AlgE7 may be introduced to the non-lyase AlgE6 by making their primary sequences more similar. Seven of the algE6-mutants contained mutations around the active site of AlgE6 in the residues 148, 172 and 194, while the last mutant was a chimeric gene of algE7 and algE6 combining the calcium binding site of AlgE7A with the active site of AlgE6. The cell extracts of the algE6-mutants were then investigated for possible lyase activity. Based on the initial tests, the calcium binding site of AlgE7A did not appear to introduce lyase activity in AlgE6. Proteins with the amino acid changes G148R, D194G and G148R/D194G, on the other hand, did show signs of lyase activity in the initial tests. They were therefore purified for further studies, which ultimately showed that these mutations did not infer lyase activity in AlgE6. This suggests that the amino acid residues at these positions are not alone in enabling the bifunctionality of AlgE7. The cell extracts of a G148R/L172K double-mutant also appeared to exhibit lyase activity in the initial tests, but was not purified for closer inspection in this project.