Disulfide-crosslinked alginate hydrogels functionalized with bioactive peptides for cell cultivation

Abstract

Hydrogeler av alginat er biokompatible og har lav immunologisk profil, noe som gjør dem attraktive for cellekultivering. På tross av disse ønskede egenskapene, vil alginat i seg selv ikke støtte viktige cellulære funksjoner som adhesjon, spredning og vaskularisering. Biofunksjonalisering av alginat gjennom å introdusere peptider med ønskede egenskaper er derfor nødvendig for å kunne kultivere celler inni de utviklede hydrogelene.

Avhengig av de ønskede egenskapene for hydrogelene, ulike bioaktive peptider kan brukes for funksjonalisering. Typisk er peptider som inneholder RGD-adhesjonsmotiver brukt, de bindes gjennom integriner uttrykt på celleoverflaten. For at celler skal kunne omorganisere omgivelsene sine kan motiver som kan kløyves av matriks-metalloproteinaser (MMP) også introduseres. Peptidsekvensen PVG↓LIG inneholder et kløyvbart område (angitt med en pil) som kløyves av MMP utrykt av enkelte celletyper. For at cellene skal kunne modifisere hydrogeler som inneholder PVG, må imidlertid peptidene være kovalent kryssbundet inni gelen. Standardtilnærmingen for a danne hydrogeler gjennom ionisk kryssbindinger er dermed ikke tilstrekkelig.

Målet med dette prosjektet var å danne hydrogeler gjennom kovalent kryssbinding. Dette ble oppnådd ved å introdusere peptider som inneholder cysteiner på C-terminus og slik muliggjøre formasjon av disulfidbindinger. Poding av høymolekylærvekts alginat LF200S ble realisert ved periodatoksidering etterfulgt av reduktiv aminering. Peptidene GRGDAC (RGD) og GPVGLIGAC (PVG) ble brukt. Etter syntese ble grad av substituering karakteriser av proton kjernemagnetisk resonans (1H-NMR) og det ble funnet at standard dialyse ikke var tilstrekkelig siden beregnede substitueringsgrader (6.8 % for RGD- og 12.5 % PVG-podet alginat) overgikk den teoretiske maksimum på 8 %. Ytterligere dialyse mot reduserende agent DTT ble foreslått og det ble vist at det var mulig å fjerne ubundet peptid. Endelig substitueringsgrad var ⁓ 5 %.

Gelering av podet materiale ble gjennomført uten tilsats av divalente kationer. RGD-podet alginat ble gelert suksessfullt ved a løse materialet i 25 mM HEPES (0.9 % NaCl, pH 7.4). ifølge reologiske analyser var geleringskinetikk av materiale avhengig av konsentrasjon av modifisert alginat. Gelstivhet varierte fra 2-1300 Pa for RGD-podet alginat i konsentrasjonsintervallet 0.5-2 %. Det ble også observert at materialet mistet geleringsegenskapene når det ble lagret i -20 ℃ over lengre tid. Geleringsegenskapene kan gjenopprettes ved å redusere materialet med DTT. Sol-gel overgangstid var avhengig av lagringstid. Gelering av PVG-podet alginat ble realisert ved å løse materialet i Milli-Q-vann for så å tilsette dimetylsulfoksid (DMSO). RGD/PVG miksede hydrogeler ble også produsert ved å bruke samme framgangsmåte. Reologiske analyser av RGD/PVG miksede materialer (2%, 1:1) viste at gelstivheten ikke overgikk den for 1% RGD-podet materiale. Lagringsmodulen form miksede materialer var imidlertid mest sannsynlig høyere siden den ikke stabiliserte seg i løpet av målingene, men fortsatte å stige.

Det ble vist at gelering av materialer syntetisert i løpet av dette prosjektet kan reverseres ved å tilsette reduserende agent DTT. Geler funksjonalisert med peptider som inneholder PVG-motivet mistet også sine mekaniske egenskaper når de ble utsatt for MMP-2.

For å undersøke cellulær respons på de utviklede hydrogelene, ble celler sådd på og inni de strukturelle nettverkene. Dette ble gjort for modifisert alginat lagret over lengre tid, noe som førte til dannelsen av porøse svamplignende nettverk istedenfor hydrogeler, og for nylig dialysert modifisert alginat som dannet hydrogeler. Cellulær respons ble observer for du kultiverte cellene.

For å oppnå hydrogeler basert på ioniske kryssbindinger i tillegg til kovalente kryssbindinger, kan ikke integriteten av alginatryggraden (kan komplekse med divalente kationer) svekkes i stor grad. I motsetning til periodatoksidering etterfulgt av reduktiv aminering vil DMTMM-aktivert amidering ikke påvirke den strukturelle integriteten til alginat. DMTMM-aktivert amidering ble dermed evaluert som en alternativ metode som gir potensiale for høy substitueringsgrad samtidig som de ionebindende egenskapene til alginat opprettholdes. L-fenylalanin-metylester (L-PheOMe) ble brukt som en modellsubstituent som ble podet til lavmolekylærvekts alginat UP VLVG i tillegg til LF200S.

Podingsreaksjonen ble gjennomført ved å bruke DMTMM eller CDMT og NMM. Sistnevnte førte til flere uønskede biprodukter, derfor ble DMTMM valgt som reagens for alginatmodifisering. Begge førte til dannelse av et ukjent L-PheOMe addukt som ikke ble fjernet verken ved dialyse eller rensing med metanol.

Grad av substituering for denne syntesen var vanskelig å beregne med 1H-NMR, siden økt mengde L-PheOMe i prøven førte til forvrenging av signalene fra alginatryggraden. Estimert substitueringsgrad ble likevel funnet å være høy, noe som indikerer at denne metoden kan benyttes for å introdusere bioaktive motiver til alginat. HMBC analyse bekreftet interaksjon gjennom en sekundær amidbinding mellom L-PheOMe og lavmolekylærvekts alginat.

Alginate hydrogels are biocompatible and have a low immunogenic profile, thus making them desirable for cultivation of cells. Despite these attractive properties of alginates, they will not by themself support important cellular functions such as cell adhesion, proliferation, and vascularization. Biofunctionalization of alginate by introducing peptides with desired properties is therefore needed to be able to cultivate cells inside the developed hydrogels.

Depending on the wanted properties for the hydrogels, different bioactive peptides can be used for functionalization. Typically used are peptides containing the RGD motif for cell adhesion through integrins expressed on the surface of the cells. For cells to be able to remodel their surroundings motifs cleavable by matrix metalloproteinases (MMPs) can also be introduced. The peptide sequence PVG↓LIG contain a cleavable site (indicated by an arrow) that can be cleaved by MMPs expressed by some cell types. However, in order for cells to be able to remodel the PVG containing hydrogel, the peptide must be covalently crosslinked within the gel. The standard approach of forming hydrogels through ionically crosslinking gel formation is thus not adequate.

This project was aimed at forming hydrogels through covalent crosslinking. By introducing peptides containing cysteines at the C-terminus, enabling formation of disulphide bridges, this was achieved. Grafting of high molecular weight (HMW) alginate LF200S was realized by periodate oxidation followed by reductive amination. The peptides GRGDAC (RGD) and GPVGLIGAC (PVG) were used. After synthesis, degrees of substitution (DS) were characterized by proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR), and it was found that standard dialysis procedures were not adequate, as calculated DS (6.8 % for RGD- and 12.5 % for PVG-grafted alginate) exceeded the maximum theoretical amount (8 %). Additional dialysis against the reducing agent DTT was suggested, and it was shown that it was possible to purify the material (remove ungrafted peptides). Final DS were ⁓5 %.

Gelation of grafted materials were conducted without addition of divalent cations. RGD-grafted alginate was successfully gelled by dissolving the material in 25 mM HEPES (0.9 % NaCl, pH 7.4). According to rheological analysis, gelation kinetic of the material was dependant on concentration of modified alginate. Gel stiffness ranged from 2-1300 Pa for RGD-grafted alginate concentrations 0.5-2 %. It was also observed that the material loses its gel forming properties when stored at -20 ℃ for longer periods of time. Gel forming properties can be restored by reducing the material with DTT. Time of sol-gel transition was dependant on time in storage. Gelation of PVG-grafted alginates was realized by dissolving the material in Milli-Q water and adding dimethyl sulfoxide (DMSO). RGD/PVG mixed hydrogels were also produced using the same approach. Rheological analysis of RGD/PVG mixed material (2 %, 1:1) showed that the gel stiffness did not exceed that of 1 % RGD-grafted material. However, storage modulus of the mixed hydrogel was probably higher than measured, as it did not stabilize but kept increasing throughout the time of analysis.

It was shown that gelation of materials synthesised in this project can be reversed by addition of reducing agent DTT. Gels functionalized with peptides containing the PVG motif were also found to lose their mechanical properties when exposed to MMP-2.

To examine the cellular response on the developed hydrogels, cells were seeded on top and inside the matrices. This was done for material stored for a longer time, causing porous sponge-like matrices to form instead of hydrogels, and for freshly dialyzed material forming hydrogels. Cellular responses to RGD- and RGD/PVG mixed materials were demonstrated, as morphological changes were seen for the cultivated cells.

To achieve hydrogels based on ionic crosslinks as well as covalent crosslinks, the integrity of the alginate backbone (containing divalent cation complexing properties) cannot be excessively compromised. Unlike periodate oxidation followed by reductive amination, DMTMM-activated amidation does not affect the structural integrity of alginate. DMTMM-activated amidation was thus evaluated as an alternative approach, giving the potential for high degrees of grafting while preserving the alginates property of ionic gelation. L-phenylalanine methyl ester (L-PheOMe) was used as model substituents to be grafted to low molecular weight (LMW) alginate UP VLVG as well as LF200S.

The grafting reaction was performed using either DMTMM or CDMT and NMM. The latter caused more unwanted byproducts, therefore DMTMM was chosen as reagent for alginate modification. Both led to the formation of an unknown L-PheOMe adduct that was not removed during dialysis, nor by additional purification with methanol.

DS for this synthesis was difficult to determine with 1H-NMR, as increased amount of L-PheOMe in the sample caused distortion of signals from the alginate backbone. Estimated DS was, nevertheless, found to be very high indicating that this method can be used for introducing bioactive motifs to alginate. Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) also confirmed grafting of L-PheOMe to LMW alginate through secondary amide bonds.