Use of Homologous Recombination to Study Alginate Biosynthesis in Azotobacter vinelandii.

Abstract

Alginat er en lineær, anionisk biopolymer bestående av mannuronsyre (M) og guluronsyre (G). Polymeren har mange bruksområder innen industri og er særlig interessant på grunn av dens evne til å danne geler, en egenskap som stammer fra interaksjoner mellom divalente kationer og G-blokker i alginaten. Egenskapene varierer avhengig av kilden, og det er økende interesse rundt alginatsyntetiserende bakterier som Azotobacter vinelandii som potensielt kan brukes til å produsere alginat med ønskede egenskaper slik som et høyere innhold av guluronsyre. Genmodifisering kan også brukes for å videre forbedre egenskapene. Denne studien ønsket å lage, verifisere og teste A. vinelandii-mutanter der flere av genene involvert i biosyntese av alginat muteres, noe som kan bidra til innsikt i alginatbiosyntesen i A. vinelandii og potensielle muligheter for å modifisere biosyntesen.

Effekten av inaktivering av algB og algW ble undersøkt ved hjelp av homolog rekombinering etterfulgt av måling av alginatproduksjon. AlgB og AlgW regulerer biosyntesegener i Pseudomonas aeruginosa positivt, hvor AlgB også er nødvendig for alginatproduksjon. Denne studien undersøkte om genene har en lignende rolle i A. vinelandii. Resultatene sammenfalt med tidligere resultater og indikerer at algB har en annen rolle i A. vinelandii da inaktivering av genet ikke så ut til å være ødeleggende for alginatbiosyntesen. Resultatene indikerte også at algW er nødvendig for alginatproduksjon i A. vinelandii, som P. aeruginosa algW. Alginatproduksjonen til en algF, mucA mutant ble også undersøkt. AlgF er ikke nødvendig for alginatproduksjon men er involvert i acetylering av mannuronsyre, som forhindrer epimerisering og lyaseaktivitet. algF-mutasjonen kunne derfor føre til et høyere innhold av guluronsyre samt en lavere molekylvekt. MucA er en anti-sigma faktor som har negativ innvirkning på alginatbiosyntesen, og mucA-mutasjonen kunne derfor medføre økt alginatproduksjon. Alginatproduksjonen til mutanten økte ikke slik som forventet, noe som indikerer at en skadelig sekundærmutasjon oppsto.

Et CRISPR-Cas9-assistert system som angriper algL ble også utviklet og testet. Homolog rekombinering er ofte ikke tilstrekkelig for å oppnå rene mutanter, siden A. vinelandii kan innholde opptil 80 kromosomkopier. En CRISPR-Cas9-vektor ble derfor brukt sammen med homolog rekombinering for å oppnå en ren algL-mutant der algL eller den mindre aktive mutanten algLH199R ble kombinert med en svakere promoter og satt inn ved hjelp av transposjon. algL er et essensielt gen som koder for en alginatlyase, og genet kan derfor ikke fjernes. Ved å introdusere en versjon av algL med lavere aktivitet var målet likevel å oppnå en mutant som produserte alginat med høyere molekylvekt. Homolog rekombinering ble også brukt til å ødelegge acetyleringsgenene algI, algV og algF, noe som kunne gi produksjon av alginat med et økt innhold av guluronsyre. Homolog rekombinering resulterte sannsynligvis i mutanter som inneholdt både villtype- og muterte kromosomer, men konjugering med CRISPR-Cas9-vektoren gav ingen transkonjuganter.

Alginate is a linear, anionic biopolymer made up of mannuronate (M) and guluronate (G). It is of great industrial interest, particularly because of its gel-forming properties which stem from interactions of divalent cations with consecutive G-blocks. The properties of alginate vary depending on the source, and alginate synthesizing bacteria such as Azotobacter vinelandii could be utilized to produce alginates with sought after properties, such as a higher G-content. Genetic engineering could further be used to alter and improve the properties of the alginate. This study aimed to construct, verify and test A. vinelandii strains with mutations to several genes believed to be involved in alginate biosynthesis, to gain insight into its biosynthesis and potential ways of manipulating it.

Inactivated algB and algW mutants were constructed by homologous recombination. AlgB and AlgW are positive regulators of biosynthetic genes in Pseudomonas aeruginosa, and AlgB is essential for alginate production. This study investigated if the algB and algW genes of A. vinelandii had similar roles by inactivating the genes and evaluating the alginate production of mutants. The results were consistent with previous findings and suggest that the role of A. vinelandii algB differs from that of P. aeruginosa in that it is not required for alginate biosynthesis. Results also indicated that algW is required for alginate biosynthesis, just like its P. aeruginosa homolog. The alginate production of an algF, mucA double mutant was also evaluated. AlgF is not essential for alginate production but is involved in acetylation of M-residues, which prevents epimerization and lyase activity. An algF mutation alone could therefore result in a higher G-content alginate with lowered molecular weight. MucA is an anti-sigma factor that impacts alginate biosynthesis negatively, and its disruption could result in increased alginate production. The double mutant was found to produce very low amounts of alginate, which is inconsistent with previous studies and suggests that a secondary mutation detrimental to alginate production occurred.

A CRISPR-Cas9 assisted system that disrupts algL was constructed and tested. Obtaining pure A. vinelandii mutants by homologous recombination alone is often challenging as the organism may contain up to 80 chromosome copies. A CRISPR-Cas9 vector was therefore used along with homologous recombination in an attempt to obtain a pure algL mutant where algL or the less efficient mutant algLH199R associated with a weaker promoter was incorporated into the genome by transposition. algL is an essential gene that encodes an alginate lyase, and the gene cannot be removed entirely. A mutant with lowered AlgL activity could however result in a higher molecular weight alginate. Homologous recombination was used to disrupt the acetylation genes algI, algV and algF in addition to wild type algL, which could increase the G-content of the alginate. Homologous recombination yielded mutants that most likely contained both wild type and mutated chromosomes, but conjugation with the CRISPR-Cas9 vector was not successful.