| dc.description.abstract | Antibiotikaresistens er en global utfordring som i de siste årene har økt kraftig. Det er observert økende resistensutvikling også i Norge og det er derfor viktig å overvåke denne utviklingen. Denne overvåkingen gjøres blant annet av referanselaboratoriet for meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) ved avdeling for medisinsk mikrobiologi ved St. Olavs Hospital. S. aureus er en gram positiv stafylokokk med hyppig resistensutvikling. Resistensutviklingen mot antibiotikumet meticillin skyldes ervervelsen av genet mecA. S. argenteus har lenge blitt feilidentifisert som S. aureus, men har i nyere tid blitt klassifisert som en egen art. Det er også oppdaget meticillinresistente stammer av S. argenteus, som følge av ervervelse av mecA.
Hensikten med denne oppgaven var å etablere en multiplex real-time PCR-metode for å identifisere meticillinresistente S. argenteus basert på målgenene yhfT, lukE og mecA. Denne bakterien identifiseres i dag med helgenomsekvensering, noe som er kostbart, ressurs- og tidkrevende. Da avdeling for medisinsk mikrobiologi ved St. Olavs Hospital har funksjon som referanselaboratorium for MRSA, er det viktig med korrekt identifikasjon. Til tross for at behandlingen for meticillinresistente S. argenteus og MRSA er lik, er det ønskelig å kunne skille dem for å overvåke virulens- og resistensutviklingen av S. argenteus.
Metodeutviklingen innebar optimalisering av qPCR og undersøkelse av metodens effektivitet, sensitivitet og spesifisitet. Primerne og probene ble først vurdert og optimalisert som singleplex qPCR, før sammenslåing til multiplex qPCR. Som et siste trinn i metodeutviklingen ble metodens validitet undersøkt. Til dette ble 40 bakteriestammer med kjent genom benyttet. I tillegg ble det undersøkt om metoden var fungerende med to ulike ekstraksjonsmetoder; kokelysering og enzymatisk ekstraksjon med instrumentet EZ1 Advanced XL fra Qiagen.
Resultatene fra dette prosjektet viser at den nye metoden har god effektivitet og sensitivitet, samt god spesifisitet basert på den valideringen som ble gjort på de kjente bakteriestammene. Metoden fungerer godt med begge ekstraksjonsmetoder.
Det kan konkluderes med at etableringen av verdens første artsspesifikke multiplex qPCR for deteksjon av meticillinresistente S. argenteus basert på målgenene yhfT, lukE og mecA var suksessfull. | |
| dc.description.abstract | Antibiotic resistance is a global threat and has increased during recent years. Increasing development of resistance has also been observed in Norway, and it is essential to surveil this development. This surveillance is done, among others, by the reference laboratory for methicillin-resistant S. aureus (MRSA) at the Department of Medical Microbiology at St. Olav's Hospital. S. aureus is a gram-positive staphylococcus with rapid development of resistance, where this methicillin resistance is due to the acquisition of the mecA gene. S. argenteus has long been misidentified as S. aureus but was recently described as a novel species. Methicillin-resistant strains of S. argenteus have also been discovered due to the acquisition of mecA.
The purpose of this project was to establish a multiplex real-time PCR assay to identify methicillin-resistant S. argenteus based on the target genes yhfT, lukE, and mecA. Today the identification of this bacteria is done with whole genome sequencing (WGS), which is costly, and resource- and time-consuming. As the Department of Medical Microbiology at St. Olav's Hospital functions as a reference laboratory for MRSA, it is essential with correct identification. Even though the treatment for methicillin-resistant S. argenteus and MRSA is the same, it is beneficial to distinguish them for surveillance of the virulence- and resistance development of S. argenteus.
The development of the qPCR assay involved optimization of the method and examination of effectivity, sensitivity, and specificity. The primers and probes were first evaluated and optimized as a singleplex qPCR before merging into a multiplex qPCR. As a final step in the development, the method's validity was examined on a selection of bacterial strains. For this validation, 40 bacterial strains with a known genome were used. In addition, it was investigated whether the method worked on two different extraction methods; boiling lysis and enzymatic extraction with EZ1 Advanced XL from Qiagen.
The results from this project show that the new method has good effectivity and sensitivity, and adequate specificity, based on the validation done on the known bacterial strains. The method is well functioning with both extraction methods.
It can be concluded that the establishment of the world's first species-specific multiplex qPCR for detecting methicillin-resistant S. argenteus based on the target genes yhfT, lukE, and mecA was successful. | |
