Generating Neural Networks from Ependymal Cells harvested after Spinal Cord Injury

Abstract

Traumatisk ryggmargsskader (tRMS) er preget av alvorlige, irreversible forstyrrelser av lokale og nevrale kretsløp i ryggmargen med ødeleggende effekt som når gjennom de supraspinale kanalene. Som svar på tRMS, blir ependymale celler, som ligger rundt ryggmargens sentralkanal, aktivert og begynner å proliferere. Aktiverte ependymale celler vandrer så mot lesjonsstedet før de starter å differensiere til nevroner og gliaceller. Likevel er differensiering til astrocytter sterkt foretrukket i vivo, som bidrar til dannelse av et glia- arr på skadestedet som forhindrer aksonal regenerering. Foreløpige studier rapporterer at sentralkanalens ependymale celler har egenskapene til nevrale stamceller, og innehar multipotente egenskaper som leder til generering av astrocytter, oligodendrocytter og nevroner i vitro. Dette gjør at ependymale celler er en attraktiv cellepopulasjon å målrette i utredningen av regenerative terapier hos pasienter med tRMS.

I vår studie laget vi snitt av ryggmargen etter tRMS for å bestemme det tidligste tidspunktet for høsting av høyhastighets-prolifererende spinale ependymale celler for dyrking i vitro. Ved å gjøre dette, var vi i stand til å i) undersøke aktivering av den nevrogene nisjen, samt inflammatoriske responser etter lesjonering, ii) etablere ependymale cellekulturer for å evaluere proliferative og differensierende kapasiteter i vitro iii) regulere disse kapasitetene ved tilskudd av mitogener (EGF og bFGF) i den proliferative fasen, og gjennom styrt/ikke-styrt differensiering ved tilskudd av NT-3, BDNF, CHIR99021 og Sonic hedgehog (Shh) i forskjellige kombinasjoner og konsentrasjoner.

Våre funn indikerer at i) tRMS fører til økt uttrykk av markørene KI67, GAP-43, GFAP, Vimentin og Iba1 rundt skadestedet 1-3 dager etter lesjon ii) Ved kvalitativ inspeksjon og celletelling under utvikling, tyder funnene på at ependymale celler prolifererte i en betydelig høyere hastighet etter tRMS sammenlignet med ependymale celler fra intakte dyr. Funnene indikerte også at ependymale celler differensierer til både gliaceller og nevroner, og at de selvorganiserer seg strukturelt (og sannsynligvis funksjonelt) i nevrale nettverk i vitro iii) tilskudd av EGF og bFGF førte til økt proliferativ aktivitet av ependymale cellerkulturer, men opprettholdt ikke alle celler i en multipotent tilstand på ubestemt tid da noen begynte å differensiere mens de fortsatt var i proliferativt stadium. Tilskudd av CHIR99021 under differensiering ledet utviklingen av nettverk som inneholdt en blanding av eksitatoriske nevroner og nevrale forgjengerceller, mens Shh førte til utvikling av nettverk som inneholdt nevroner som morfologisk lignet motoriske nevroner, men som ikke ble bekreftet på grunn av delvis uklare resultater fra immunocytokjemien.

Avslutningsvis fører tRMS til lokal inflammatorisk respons, aktivering av ependymal celleproliferasjon i ryggmargen, samt nevroplastiske mekanismer som kontinuerlig øker i løpet av de første 3 dagene etter lesjon. Videre, så proliferer og differensierer spinale ependymale celler i vitro, ved styrt eller ikke-styrt differensiering som muligens kan generere dorsale eksitatoriske projeksjonsnevroner og ventrale motoriske nevroner. Noen av resultatene var imidlertid tvetydige, og ingen definitive konklusjoner kunne trekkes med hensyn til aktivering av WNT (CHIR99021) og Shh-signalveiene på de ependymal- genererte nevrale nettverkene. Likevel viser metodene som er brukt i denne studien potensial som fortjener ytterligere optimalisering og utredning i fremtidige studier.

Traumatic spinal cord injury (tSCI) is characterized by severe irreversible disruptions of local and neural circuits in the spinal cord (SC), with devastating effects reaching throughout the supraspinal tracts. In response to tSCI, spinal canal ependymal cells (ECs) proliferation are activated, and they migrate towards the lesion site before differentiating into cells of neuronal and glial lineage. Differentiation into astrocytes is heavily favored in vivo that contribute to the formation of a glial scar at the injury site, preventing axonal regeneration. Previous studies report that SC ECs harbor neural stem cell (NSC) characteristics and multipotentiality leading to the generation of astrocytes, oligodendrocytes and neurons in vitro. This makes SC ECs an attractive cellular population to target in the investigation of regenerative therapies in patients with traumatic spinal cord injury.

In our study, we made SC sections after tSCI to determine the earliest time point for harvesting of high-rate proliferating SC ECs for culturing in vitro. By doing so, we were able to i) investigate neurogenic niche activation and inflammatory responses post- lesioning, ii) establish EC cultures to evaluate their proliferative and differentiative capacities in vitro iii) regulate these capacities by the supplementation of mitogens (EGF and bFGF) during the proliferative phase, and through directed/undirected differentiation by the supplementation of NT-3, BDNF, CHIR99021 and Sonic hedgehog (Shh) in different combinations and concentrations.

Our findings indicate that i) tSCI leads to increasing expressions of KI67, GAP-43, GFAP, Vimentin and Iba1 in vivo around the lesion site in the timescale of 1-3 days post-lesioning ii) By qualitative inspection and cell counts during development, the findings suggested that ECs proliferate at a significantly higher rate after tSCI, differentiate down both a glial and neural lineage, and structurally (and likely functionally) self-organize into neural networks in vitro iii) supplementation of EGF and bFGF led to increased proliferative activity of EC cultures, but did not maintain all cells in a multipotent state indefinitely as some started differentiating while still in the proliferative stage. Supplementation of CHIR99021 during differentiation led the development of networks that possibly contained a mixture of excitatory neurons and neural progenitors, while Shh led to development of networks that contained neurons that morphologically resembled motor neurons, though unconfirmed due to partially inconclusive ICC expressions of the Arc and Islet-1 markers.

In conclusion, tSCI leads to localized inflammatory response, activation of spinal cord EC proliferation and neuroplastic mechanisms that continuously increase within the first 3 days post-lesioning. Furthermore, SC ECs proliferate and differentiate in vitro, by undirected or directed differentiation that might possibly generate dorsal excitatory projection neurons and ventral motor neurons. However, some of the results were inconclusive, and no definitive conclusions could be drawn in regard to the effects of WNT pathway activation (CHIR99021) and Sonic Hedgehog on the ependymal-derived neural networks. Nevertheless, the methods used in this study show potential that deserves further optimization and investigation in future studies.

Keywords: Traumatic spinal cord injury, Ependymal cells, NSC, In vitro, Motor neurons, Dorsal excitatory relay neurons, Neurogenic niche.