Evaluation of Real-Time PCR for rapid phenotypic susceptibility testing of Escherichia coli to gentamicin

Abstract

Slappe strategier for infeksjonskontroll og høyt forbruk av antimikrobielle stoffer i noen land gir god grobunn for resistente bakterier, og med en svært sammenkoblet verden kan mikrober spre seg fort. Blodstrømsinfeksjoner (BSI) er en av de syv største årsakene til død i Nord-Amerika og Europa, og i Norge, som resten av verden, er det en økning i tilfeller av BSI. Denne økningen kombinert med økningen i antimikrobiell resistens, gir utfordringer for mange helseinstitusjoner i å gi effektiv og tidlig behandling til flere pasienter. Optimalisert behandling kan gis når alle laboratorier tester er kjørt, som gramfarging, organisme ID og antimikrobiell følsomhets testing (AFT). De fleste AFTer brukt nå bygger på kulturer, som betyr at de baserer seg på bakteriens evne til å vokse. EUCAST metoder for AFT varierer fra 18 ± 2 timer til 4 timers inkubasjon. On man kunne detektere antimikrobiell følsomhet raskere, kan optimalisert behandling gis tidligere og de kliniske utfallene bedres. Dette prosjektets mål er å fenotypisk avgjøre følsomhetsprofiler for E. coli isolater fra BSI mot gentamicin vha. en Real-Time PCR metode. Prosjektet vil også evaluere en kokelyseringsmetode for rask DNA preparasjon, og optimere inkubasjonstiden for E. coli i Muellr-Hinton buljong for å differensiere følsomme og resistente stammer. En Real-Time PCR ble etablert som målte relativ forandring ï 16S rRNA genet. Fjorten stammer E. coli ble ble individuelt inkubert i Mueller-Hinton buljong med og uten gentamicin. De fleste vekstforsøk varte i 2.5-5 timer. Kokelyseringsmetoden ble optimalisert og ble brukt som DAN preparasjon før Real-Time PCRen. Kokelyseringen ble også sammenlignet med en kommersiell automatisk DNA ekstraksjonsmetode, EZ1. Turbiditet ble målt for vekstkurvene spektrofotometrisk på 600 nm (OD600). Real-Time PCRen etablert for 16S rRNA genet var basert på St. Olavs hospitals Real-Time PCR for 16S rRNA gen deteksjon fra direkte materiale. Å avgjøre om stammer var resistente eller følsomme tok 4 timer med inkubering ved å bruke kokelysering og Real-Time PCR. Med kun OD600 målinger tok det 1.5 time med inkubering for å differensiere resistente og følsomme stammer. Den automatiske DNA ekstraksjonen, EZ1, hadde et lavere EZ1 lavere tidsbruk, «hands-on» arbeid og mer stabile resultater enn kokelysering. En økning i 16S rRNA genet i gentamicin-buljongen ville bety vekst, som indikerer at bakterien er resistent. Å detektere bakteriell vekst vha. Real-Time PCR virket for upålitelig pga. det svake forholdet mellom vekst og Cq-verdier, en 10-folds økning i DNA templat er nødvendig for en 3,32 reduksjon i Cq-verdi. Avhengig av ressurser, virker den automatiske DNA ekstraksjonen som et bedre valg for bakteriell DNA preparasjon. Kokelyseringen produserte mindre konsise resultater og brukte lenger tid enn EZ1. OD600 målinger virket som et mye bedre valg for deteksjon av bakteriell vekst pga. det direkte forholdet mellom celletetthet og turbiditet. Bare en liten gruppe stammer E. coli ble testet. Det ville være interessant teste både flere grupper av bakterier og antimikrobielle stoffer i forskjellige kombinasjoner. Et interessant perspektiv å utforske ville være muligheten for mikrobuljongfortynninger med forkortet inkubasjonstid med prøver direkte fra blodkultur.

Relaxed strategies in infection control and high antimicrobial use in some countries give rise to resistant bacteria, which may easily spread in the modern interconnected world. BSIs are among the top seven causes of death in North America and Europe. In Norway, and the world, there are increased incidence rates of bloodstream infections (BSI). The rise in BSI rates combined with the ever-increasing rate of antimicrobial resistance, composes a challenge for health care facilities to give accurate, and timely treatment to even more patients. Optimised treatment can be given when all laboratory tests have been run, gram staining, organism ID and AST. Most ASTs used today are culture based, meaning they rely on the ability of the bacteria to grow. EUCAST methods for AST vary from 18 ± 2 hours to 4 hours incubation time. If one could detect antimicrobial susceptibility faster, optimised treatment could be given sooner thus improving clinical outcomes. This project’s aim is to phenotypically determine the susceptibility profile of E. coli isolated from BSI to gentamicin through a Real-Time PCR-method. It will evaluate a boiling lysis method for fast DNA preparation and optimise the incubation period of E. coli in Mueller-Hinton broth to distinguish resistant and susceptible strains. A Real-Time PCR assay was established, and it measured the relative change in the 16S rRNA gene. Fourteen strains of E. coli were individually incubated in Mueller-Hinton broth with and without gentamicin. Most growth experiments lasted 2.5-5 hours. The boiling lysis method was optimised and used when preparing DNA for the Real-Time PCR. Boiling lysis was also compared to a commercial automatic DNA extraction method, EZ1. Turbidity was measured for growth curves spectrophotometrically at 600 nm (OD600). The Real-Time PCR established for the 16S rRNA gene was based on St. Olavs hospital’s Real-Time PCR for 16S rRNA gene detection from direct material. To determine if strains were susceptible or resistant it took 4 hours of incubation if using boiling lysis and Real-Time PCR. Using only OD600 measurements, it took 1.5 hours of incubation to distinguish susceptible and resistant strains. The automated DNA extraction method, EZ1, had lower run time, hands-on work, and more stable results than boiling lysis. An increase in the 16S rRNA gene in the gentamicin broth would indicate growth, meaning the bacteria was resistant. Detecting bacterial growth using Real-Time PCR seemed unreliable due to the weak relationship between growth and Cq-values, a 10-fold increase in DNA template is needed for a 3.32 decrease in Cq-value. Depending on available resources, automated DNA extraction, EZ1, seems to be the better choice for bacterial DNA preparation. Boiling lysis produced less consistent results and took longer to perform than EZ1. OD600 measurements seems a better option for detecting bacterial growth because of the direct correlation between cell density and turbidity. Only a small selection of E. coli stains were tested. It would be advantageous to test both a larger group of bacteria and antimicrobials in different combinations. An interesting thought to explore would be the possibility of broth microdilutions directly from blood culture samples with a shortened incubation time.