Show simple item record

dc.contributor.advisorBruland, Torunn
dc.contributor.advisorBakke, Ingunn
dc.contributor.advisorGopalakrishnan, Shreya
dc.contributor.authorOsoble, Nimo Mukhtar Mohamud
dc.date.accessioned2021-09-25T16:35:10Z
dc.date.available2021-09-25T16:35:10Z
dc.date.issued2021
dc.identifierno.ntnu:inspera:80587189:49522573
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11250/2783324
dc.descriptionFull text not available
dc.description.abstractBakgrunn: Inflammatorisk tarm sykdom (IBD) er en samlebetegnelse for kroniske inflammatoriske sykdommer som rammer tarmen, og inkluderer Crohns sykdom og ulcerøs kolitt. Årsaken til IBD er fortsatt ukjent, men man tror at fysiske, biokjemiske og immunologiske mekanismer i tarmepitelceller har viktige roller i patogenesen og vedlikehold av IBD. Det er få legemidler i dag som direkte går på tarmepitelcellene eller slimhinne tilhelingen, og det er lite informasjon om effektene av JAK-hemmer tofacitinib på funksjonene til tarmepitelceller. Problemstilling: Målet med denne masteroppgaven var å utforske hvordan tarmorganoider fra kolon (kolonoider) vokser og reagerer på ekstracellulære signaler ved høyt (20%) og lavt (2%) oksygen (O2) nivå, hvordan tofacitinib påvirker vekst og celle død i kolonoider og hvordan tofacitinib kan modulerer TNF og Poly(I:C) indusert utskillelse av kjemokinene CXCL11 og CXCL1 fra kolonoider. Metode: Kolonoider fra IBD pasienter og friske kontroller ble brukt som modell system for å evaluere effekten av tofacitinib på tarmepitelceller. To forskjellige inkubatorer ble brukt for å dyrke kolonoidene under 20% O2 eller 2% O2, med ekstra N2 gass for å holde oksygenet lavt i en inkubator. Vekst, celledød, morfologi og utskillelse av kjemokiner ble analysert med EVOS® FL Auto II Fluorescence Microscope, Caspase-Glo® 3/7 assay, H&E farging av snitt fra parafininnstøpte kolonoidpelleter og ELISA (enzyme-linked immune sorbent assay). Resultat: Tarmorganoider fra kolon hadde bra vekst fra enkle celler til fullt differensierte kolonoider ved både 2% og 20% O2. Kolonoidene vokste bra og stabilt ved 2% O2 for alle donorene. Kolonoidene vokste seg større i 20% O2 enn i 2% O2, men de viste seg å være mindre stabile i deres størrelse og tetthet enn ved 2% O2. Tofacitinib induserte mer vekst og formering av ballong formede colonoider ved økende dose. Vi observerte også at kolonoider forbehandlet med 10µM og 50µM tofacitinib var mer beskyttet mot celle død indusert av TNF og poly(I:C) enn ubehandlede kontroller. Tofacitinib viste også å ha beskyttende effekter mot TNF og poly(I:C) indusert caspase 3/7 aktivitet. Resultatene fra ELISA viste redusert sekresjon av CXCL11 fra kolonoider når de ble for-behandlet med tofacitinib og stimulert med TNF og poly(I:C). Frigjøringen av CXCL1 var enten ikke påvirket eller økte når tofacitinib ble tilsatt. Dette kan indikere at tofacitinib ikke hemmer signalveien for CXCL1 frigjøring i epitel celler, men kan ha en stimulerende effekt. Konklusjon: Observasjoner fra langtids vekst av kolonoider ved lavt oksygen nivå indikerer at in-vitro studier med kolonoider kan bli utført ved lav oksygen konsentrasjon lignende den vi finner i in vivo epitelcellemiljø. Tofacitinib har kanskje lovende effekter på regenerering av tarmepitel og kan være beskyttende mot pro-inflammatoriske signaler. Videre forskning er nødvendig, og det trengs flere biologiske replikater med kolonoider fra flere forskjellige donorer for å kunne trekke en konklusjon.
dc.description.abstractBackground: Inflammatory bowel disease (IBD) is a collective name for chronic inflammatory diseases that affects the gastrointestinal tract and includes Crohn’s disease and ulcerative colitis. The etiology for IBD is still unknown but it is taught that physical, biochemical, and immunologic driven barrier dysfunctions of epithelial cells (IECs) have important roles in the pathogenesis and perpetuation of IBD. There are few drugs targeting directly IECs and mucosal healing today, and there is little information about the effects of the JAK-inhibitor tofacitinib on intestinal epithelial cell functions. Aim: The aim of this thesis was to investigate how the colonoids grow and respond to extracellular signals at high (20%) and low (2%) oxygen (O2) concentrations, how tofacitinib affects the growth and cell death in colonoids and how tofacitinib can modulate TNF and poly(I:C) induced secretion of chemokines CXCL11 and CXCL1 from colonoids. Methods: Intestinal epithelial colonoids derived from IBD-patients and healthy controls were used as a model system to evaluate the effects of tofacitinib on intestinal epithelial cells. Two different incubators were used to maintain colonoids under high and low oxygen concentration, with additional N2 gas input to maintain low oxygen concentration in one incubator. Growth, cell death, morphology and chemokine secretion were analyzed by using EVOS® FL Auto II Fluorescence Microscope, Caspase-Glo® 3/7 assay, H&E staining of paraffin embedded colonoid pellets, and enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA). Results: Intestinal colonic organoids had good growth from single cells to fully differentiated colonoids at both 2% and 20% O2. The colonoids grew well and stable at 2% O2 across different donors. The colonoids grew bigger at 20% O2 than in 2% O2, but they turned out to be less stable in terms of their size and density at 20% O2. Tofacitinib induced enhanced growth and formation of balloon shaped colonoids in a dose-response manner. We observed that the colonoids pre-treated with 10µM and 50µM tofacitinib were protected against cell death induced by TNF and poly(I:C). Tofacitinib showed also to exert protective effects against TNF and poly(I:C) induced caspase 3/7 activity. Results from ELISA showed reduced secretion of CXCL11 from colonoids when pre-treated with tofacitinib and stimulated with TNF and poly(I:C). The release of CXCL1 was either not effected or increased in tofacitinib treated cultures compared to controls, which could indicate that tofacitinib does not affect the pathway for CXCL1 release in epithelial cells but can have a promoting effect. Conclusions: Observations from long-term culturing of colonoids at low oxygen concentration indicates that in-vitro studies with colonoids can be performed at low oxygen concentration similar to the in vivo epithelial cell environment. Tofacitinib might have promising effects on regeneration of intestinal epithelium and protection against pro-inflammatory signaling. Further research is needed with more biological replicates and experiments in colonoids derived from more donors to have a better conclusion.
dc.languageeng
dc.publisherNTNU
dc.titleStudies of the JAK-inhibitor Tofacitinib on IBD-patient derived intestinal colonoids
dc.typeMaster thesis


Files in this item

FilesSizeFormatView

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record