Effects of overexpressing NOR-1 on cell death and cell viability in human cardiomyocytes during doxorubicin-induced stress

Abstract

Koronar hjertesykdom er den ledende dødsårsaken i verden, karakterisert av redusert blodforsyning til hjertet. Ubehandlet kan dette føre til en fullstendig blokkering av koronararteriene, kjent som et hjerteinfarkt. Gjenåpning av den blokkerte arterien er kritisk for å unngå irreversibel skade på hjertet. Paradoksalt nok, så kan reperfusjon i seg selv skade kardiomyocyttene i hjertet på grunn av blant annet kraftig økning i reaktive oksygenforbindelser. Denne skaden kalles reperfusjonsskade og det finnes per i dag ingen optimale behandlingsmetoder for å unngå dette. Doksorubicin (DOX), en ofte brukt kreftmedisin, er også kjent for å være toksisk for kardiomyocytter på grunn av økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser. Trening kan beskytte hjertet mot både reperfusjonsskade og DOX-indusert hjerteskade, men den eksakte mekanismen er fortsatt ukjent. Videre så er det vist at nuclear receptor 4A3 (NR4A3), som koder for proteinet neuron-derived orphan receptor 1 (NOR-1), er det genet som responderer mest på trening og inaktivitet i skjelettmuskulatur. Vår hypotese var derfor at NOR-1 kunne beskytte kardiomyocytter mot oksidativt stress forårsaket av DOX. I tillegg var hypotesen vår at NOR-1 kunne forberede kardiomyocyttene mot en eventuell stress-situasjon i ustimulerte forhold ved å øke celleviabiliteten. AC16 kardiomyocytter ble transfektert med en vektor som inneholdt NR4A3 genet for å overuttrykke NOR-1. Kardiomyocyttene ble så delt inn i enten en DOX-behandlet gruppe, som ble utsatt for 5 µM DOX i 12 timer, eller en ustimulert kontrollgruppe. AC16 kardiomyocytter transfektert med en tom vektor fungerte som en kontroll i begge gruppene. Laktatdehydrogenase (LDH)-, 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)- og caspase-3 aktivitetsanalyser ble utført for å måle henholdsvis celledød, celleviabilitet og apoptose. I tillegg ble western blot utført for å måle utrykket av forskjellige proteiner som er kjent for å være hjertebeskyttende. I denne studien viste vi at overuttrykk av NOR-1 reduserte celledød (P<0,05) og apoptose (P<0,01), mens celleviabiliteten økte (P<0,05) i DOX-behandlede AC16 kardiomyocytter. Vi observerte i tillegg en økning i fosforyleringen av ekstracellulær signal-regulert kinase (ERK) (P<0,01) og økt proteinuttrykk av B cell lymfoma-extra large (Bcl-xL) (P<0,01). Vi så ingen signifikant endring i fosforyleringen av protein kinase B (Akt), glykogen syntase kinase-3β (GSK-3β) og signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), eller proteinutrykket av superoksid dismutase 2 (SOD2) og syklin 1. Under ustimulerte forhold, så førte overuttrykk av NOR-1 til økt celleviabilitet (P<0,0001), uten å påvirke celledød eller apoptose. Ingen signifikante endringer i de tidligere nevnte proteinene ble observert. Våre funn kan tyde på at NOR-1 beskytter hjerteceller i respons til stress.

Ischemic heart disease (IHD) is the leading cause of death globally, characterized by reduced blood flow to the heart muscle. If left untreated, a complete blockage of the coronary arteries can occur, known as a myocardial infarction (MI). Restoration of the blood flow is critical to prevent irreversible damage to the heart. However, the reperfusion can itself damage the cardiomyocytes (CMs) in the heart because of the excessive formation of reactive oxygen species (ROS), among other things. This damage is called reperfusion injury (RI), and there is currently no optimal treatment to prevent this. Doxorubicin, a widely used anti-cancer drug, is also known to cause cardiotoxicity because of excessive ROS production. Exercise training has been shown to protect the heart against both RI and DOX-induced cardiotoxicity, but the exact mechanism is still unknown. Furthermore, nuclear receptor 4A3 (NR4A3), coding for the protein neuron-derived orphan receptor 1 (NOR-1), is an important exercise- and inactivity-responsive gene in skeletal muscle. Therefore, we hypothesized that NOR-1 could protect CMs against oxidative stress induced by DOX. We also hypothesized that NOR-1 is involved in preparing the CMs against a stress situation during nonstimulated conditions by increasing cell viability. AC16 CMs were transfected with an NR4A3 expression vector and divided into either a DOX treated group, receiving 5 µM of DOX for 12 hours, or a nonstimulated vehicle-treated group. AC16 CMs transfected with an empty vector served as controls in both treatment groups. Lactate dehydrogenase (LDH) activity, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), and caspase-3 activity assays were performed to measure cell death, cell viability, and apoptosis, respectively. In addition, western blotting on cell lysate was used to determine expression levels of several proteins known to be involved in cardioprotection. We demonstrated that NOR-1 overexpression decreased cell death (P<0,05) and apoptosis (P<0,01) while increasing cell viability (P<0,05) in DOX-treated AC16 CMs. We also observed that NOR-1 overexpression increased phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) (P<0,01) and protein expression levels of B cell lymphoma-extra large (Bcl-xL) (P<0,01). We did not measure any significant changes in phosphorylation of protein kinase B (Akt), glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) or expression levels of superoxidase dismutase 2 (SOD2) and cyclin D1. Furthermore, we demonstrated that NOR-1 overexpression increased the cell viability (P<0,0001) of AC16 CMs during nonstimulated conditions without affecting cell death or apoptosis. No changes in expression levels of previously mentioned proteins were observed after NOR-1 overexpression. Thus, our findings indicate that NOR-1 could serve as a potential cardioprotective protein in response to cellular stress.