Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorVadstein, Olav
dc.contributor.advisorBrembu, Tore
dc.contributor.authorBentzen, Kristin Leonore Lillebo
dc.date.accessioned2021-09-25T16:16:36Z
dc.date.available2021-09-25T16:16:36Z
dc.date.issued2021
dc.identifierno.ntnu:inspera:80893693:46962437
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11250/2782679
dc.description.abstractKiselalger er en type encellede eukaryote alger med en stor og diversifisert gruppe, estimert til rundt 100 000 arter. De er kjent for sin evne til å lage svært komplekse strukturer som består av artsspesifikke porøse silika mønstre (SiO2) som utgjør celleveggen, eller frustulen som dannes i spesifikke organeller kalt silika-deponeringsvesikler (SDV). Cellevegg biosyntesen er en kompleks prosess, hvor et stort antall gener og komponenter som er involvert, og vår forståelse av den er fortsatt ufullstendig. Hittil har mange viktige komponenter i Cellevegg biosyntesen blitt identifisert. I denne masteroppgaven ble det gjort et forsøk på å skape mutanter med enkle og doble knockout-linjer for to gener som koder for Tp24711 og Tp24708, som er nært beslektede gruppe II silikaniner i kiselalgen Thalassiosira pseudonana. Cellene ble transformert ved bruk av en vektor som inneholdt genene for sgDNA med den spesifiserte målsekvensen og det passende genet for Cas9-proteinet, hvor CRISPR / Cas9-komplekset ble levert gjennom bakterie konjugering. Målet er å bedre forstå hvordan disse silikaninene påvirker dannelse av celleveggen, samt funksjonene og egenskapene til de enkelte genene. For å oppnå dette vil formen på celleveggen og celleutvikling bli undersøkt. I tillegg ble to gener, Tp24711 fra silicanin-gruppe II og Tpbd856-1852 fra silicanin-gruppe III, undersøkt ved bruk av fluorescens proteinfusjon med den fluorescerende markøren mTurquoise for å identifisere posisjonene til genproduktene in vivo. Plasmidet som inneholder de amplifiserte fragmentene (innsatsene) vil bli konjugert i T. pseudonana og analysert under et mikroskop for å bestemme plasseringen av genproduktet in vivo. Sanger-sekvensering avdekket ingen mutasjoner i genene som koder for Tp24711 og Tp24708 i motsetning til noen forskjeller i koloniene på gel bilder. Til tross for mangel på bevis for Cas9-indusert mutasjon, viser resultatene at episomet er til stede i et lite antall celler, men liten andel av cellene. Som et resultat krever cellene som har episomet en lengre inkubasjonsperiode, da cellene mest sannsynlig vil gjennomgå flere celledelinger før mutasjoner kan observeres. Et annet alternativ er at kloningsmetoden for bakteriekonjugering er ineffektiv for T. pseudonana, og at forskjellige klonings metoder er nødvendige for dette spesifikke kiselalgen. Videre antyder funnene at seleksjonsmarkøren nat (nourseothricin resistent gen) er utilstrekkelig for å få cellene til å beholdet episoden. En annen seleksjonsmarkør er nødvendig på det grunnlag at antibiotika NOU er mistenkt for å forstyrre proteinsyntese. T. pseudonana-linjer som uttrykker mTurquoise-merkede Tp24711 og Tpbd856-1852 proteiner for å oppdage plassering in vivo ble ikke oppnådd, noe som antyder at andre kloningsprosesser bør testes ut.
dc.description.abstractDiatoms are a type of unicellular eukaryotic algae that has a large and diversified group, with an estimated 100 000 species. They are known for their ability to create highly complex structures made up of species-specific porous silica patterns (SiO2) that make up the cell wall, or frustule, which is formed inside the silica deposition vesicle (SDV). The process of frustule biosynthesis is complex, including a huge number of genes and compounds, and our understanding of it is still incomplete. However, many important components of the biosynthesis process have been identified. In this work, single and double knockout lines for two genes encoding Tp24711 and Tp24708, which are closely related group II silicanins, in the diatom Thalassiosira pseudonana were used to try to create a mutant strain. The cells were transformed using a vector containing the genes for the sgDNA containing the specified target sequence and the appropriate gene for the Cas9 protein, and the CRISPR/Cas9 complex was delivered through bacterial conjugation. The goal is to understand more about how these silicanins affect frustule formation as well as the functions and properties of the individual genes. In order to achieve this the shape of frustules and cell development will be examined. In addition, two genes, Tp24711 from the silicanin group II and Tpbd856-1852 from the silicanin group III, were examined using fluorescence protein fusion with the fluorescent marker mTurquoise to identify the positions of the gene products in vivo. The plasmid containing the amplified fragments (inserts) would be conjugated into T. pseudonana and analysed under a microscope to determine the location of the gene product in vivo. Sanger sequencing revealed no alterations in the genes encoding Tp24711 and Tp24708 in contrast to certain anomalies in the colony PCR. Despite the lack of evidence of Cas9-induced mutation, the findings show that the episome is present in a small number of cells, but not in an overwhelming amount. As a result, episome-containing cells require a longer incubation period, as the cells are most likely to undergo multiple cell divisions before modifications can be observed. Another option is that the bacterial conjugation cloning method is ineffective for T. pseudonana, and that different cloning methods are necessary for this diatom species. Furthermore, the findings imply that the selection marker nat (nourseothricin resistant gene) is insufficient to encourage the episome to be retained. Another selection marker is needed because the antibiotic NOU is suspected of interfering with protein synthesis. T. pseudonana cell lines expressing mTurquoise-tagged Tp24711 and Tpbd856-1852fusion proteins to detect location in vivo were not accomplished, implying that other cloning processes should be tested out.
dc.languageeng
dc.publisherNTNU
dc.titleFunctional studies of two genes encoding closely related group II silicanins in the diatom Thalassiosira pseudonana
dc.typeMaster thesis


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel