Functional studies of a family of ankyrin repeat-containing proteins in the diatom Thalassiosira pseudonana hypothesized to be involved in frustule morphogenesis

Abstract

Dannelse av cellevegg hos kiselalger er et enestående eksempel på biomineralisering. Celleveggen består av detaljrike, artsspesifikke mønster av silika (SiO2), som dannes i spesifikke organeller kalt silika-deponeringsvesikler (SDV). Celleveggsyntese hos kiselalger er en kompleks prosess, der mange ulike gener og komponenter er involvert. I denne masteroppgaven ble en proteinfamilie i kiselalgen Thalassiosira pseudonana studert, karakterisert ved repeterende ankyrin motiver. Disse proteinene kan være involvert i celleveggsyntese ved å koble cytoskjelettet til transmembrane proteiner i SDV-membranen. Funksjonelle studier av to utvalgte medlemmer av denne proteinfamilien, Tp21058 og Tp23225, ble gjennomført. Proteinenes lokalisering i cellen ble undersøkt ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi av mNeonGreen-fusjoner av proteinene. Mulige interaksjoner med cytoskjelettet ble studert ved å undersøke om behandling med aktin- og mikrotubuli-inhibitorene cytochalasin D, colchicine og oryzalin førte til endret lokalisering av fusjonsproteinene. Effekten av cellesyklusinhibitoren NU2058 ble også undersøkt, for å studere lokalisering og utrykk av fusjonsproteinene spesifikt i G1-fasen av cellesyklusen. I tillegg ble det forsøkt å slå ut de to genene Tp21058 og Tp23225 ved å bruke CRISPR/Cas9-basert geneditering, samt å studere mulige interaksjoner med silikaniner og silikalemma-assosierte proteiner (SAP) ved hjelp av Förster resonansenergioverøring (FRET)-mikroskopi. Lokaliseringsstudiene indikerer en mulig funksjon i celleveggsyntese for både Tp21058 og Tp23225. Fusjonsproteinene ble observed i celledelingsplanet, assosiert med det som kunne være SDV-strukturer i cellen. Lokaliseringen av proteinene ble ikke påvirket av behandling med cytoskjelettinhibitorer, noe som kan indikere at proteinene ikke er involvert i interaksjoner med cytoskjelettet. Analysen etter behandling med NU2058 kan tyde på at Tp21058 er svakere uttrykt i G1-fasen av cellesyklusen, mens ingen endring ble observert for Tp23225. Begge proteinene hadde hovedsakelig vesikulær lokalisering i G1. Verken eksperimentene som omhandlet å slå ut Tp21058 og Tp23225, eller interaksjonsstudiene ved hjelp av FRET var vellykkede, og ga dermed ingen ny informasjon angående proteinenes funksjon. Funnene i denne oppgaven indikerer at ankyrin-proteinene i T. pseudonana trolig er involvert i celleveggsyntese, men gir ingen konkret informasjon om proteinenes spesifikke funksjon.

Formation of the diatom cell wall, or frustule, is a remarkable example of biomineralization, where species-specific patterns of silica (SiO2) with nano- and microscale features are formed inside the silica deposition vesicle (SDV). The process of frustule formation is complex, involving a large number of genes and components. This master thesis aimed to investigate a possible involvement in frustule synthesis for a family of ankyrin repeat (AR) proteins found in the genome of the centric diatom Thalassiosira pseudonana. These AR proteins are hypothesized to be involved in linking proteins in the membrane of the SDV, called the silicalemma, to the cytoskeleton. Functional studies of two of the AR proteins, Tp21058 and Tp23225, were performed. Subcellular location was studied by confocal laser scanning microscopy (CLSM) of mNeonGreen(mNG)-tagged fusions of the proteins. Their putative interaction with the cytoskeleton was studied by investigating how treatment with the actin and microtubule inhibitors cytochalasin D, colchicine and oryzalin affect the subcellular localization. The effect of the cell cycle inhibitor NU2058 was investigated by CLSM and flow cytometry, in order to study the subcellular localization and expression of the proteins specifically in the G1 phase of the cell cycle. It was additionally attempted to create Tp21058 and Tp23225 knockout lines by using CRISPR/Cas9-based gene editing, in order to gain more information about the function of the proteins. Finally, it was aimed to study interactions with silicalemma-spanning proteins belonging to two different protein families, the silicanins and the silicalemma-associated proteins (SAPs), by using Förster resonance energy transfer (FRET) imaging. Both the creation of knockout lines and the creation of constructs for FRET imaging were unsuccessful, and these experiments did thus not yield any new information regarding the function of the AR proteins. The studies by CLSM, however, indicate that both proteins could be involved in frustule synthesis, as they were frequently observed associated with SDV structures in the cells. Inhibition of the microtubule and actin cytoskeleton did not influence the subcellular localization of the proteins, possibly indicating no interactions with the cytoskeleton. Treatment with the cell cycle inhibitor NU2058 resulted in an overall reduction in mNG fluorescence for Tp21058, while mNG-Tp23225 expression seemed not to change. Both proteins were mainly localized in intracellular vesicles in the G1 phase of the cell cycle. From the findings in this thesis, it can be concluded that the AR proteins likely are involved in frustule synthesis, but their exact function remains unknown.