Next generation recombinant viral vectors: an investigation of enhancer driven transgene expression in the subthalamic nucleus after viral vector mediated transfection.

Abstract

Den subthalamiske kjernen (STN) inngår i en signalkrets i de basale gangliene (BG), og denne kretsen er dysfunksjonell hos pasienter med Parkinsons sykdom (PD), noe som resulterer i bevegelsesforstyrrelser. Dyp hjernestimulering (DBS) av STN har vist seg å kunne lindre motoriske symptomer, men den underliggende mekanismen av effekten er ikke kjent. Flere optogenetiske studier har forsøkt å etterligne effekten av hjernestimulering for å bedre forstå hvilke undergrupper av nevroner og hvilken type stimulering som er ansvarlig for den observerte effekten, men de anvendte metodene har hatt begrenset celletype-spesifisitet, noe som har resultert i inkonsekvente resultater. Dette viser at det er et behov for transgene verktøy som kan overgå spesifisitetsnivået til eksisterende metoder, slik at man kan manipulere STN mer målrettet og dermed kanskje få svar på mekanismen bak hjernestimulering.

Hovedmålet med denne oppgaven var å bruke en nyetablert metode, kalt Enhancer Drevet Gen-Utrykk (EDGE), for å teste om enhancer-sekvenser kan aktivere celletypespesifikt uttrykk av transgenet i eller innad i STN, når plasmidet med transgenet transfekteres ved bruk av modifiserte adeno-assosierte virus (AAV). For å identifisere enhancer-sekvenser, samlet vi inn og analyserte tidligere publiserte kromatin-immunopresipitering-sekvensering (ChIP-seq)-data. En liste med 50 antatte enhancer-sekvenser ble redusert til 8 gjennom noen satte kriterier relatert til genetisk sekvens og assosierte gener. Deretter ble hver enhancer-sekvens klonet inn i en AAV-vektor som var designet for å forsikre at et hvert transgent GFP-uttrykk ville være et resultat av enhancer-aktivitet. Fra AAV-vektorene ble EDGE rekombinante AAVs (rAAVs) produsert og injisert i STN på mus. Etter å ha behandlet hjernevevet ved bruk av immunhistokjemi, ble den anatomiske lokaliseringen av GFP-merkede celler i mus injisert med EDGE rAAV sammenlignet med universelt uttrykte kontrollvirus for å svare på om de antatte enhancer-sekvensene drev uttrykk spesifikt for STN.

Syv injeksjoner, som da inkluderte fire enhancer-sekvenser, ble evaluert. Tre av enhancer-sekvensene ga uttrykk i STN, og to injeksjoner av to av enhancer-sekvensene ga uttrykk utelukkende i STN. Observasjonene gir indikasjoner på spesifisitet, men samtidig ble det også observert at når de samme vektorene (med samme enhancer-sekvens) ble injisert i andre mus, resulterte det i genuttrykk også utenfor STN. Dette kan tyde på at det kan være andre faktorer enn enhancer-sekvensen som driver den observerte spesifisiteten. De fremtredende fibertraktene i STN-området kan ha påvirket spredningen av virus, og i tillegg var det ikke alle injeksjonene som traff STN perfekt. De nåværende data hverken bekrefter eller avkrefter om enhancer-sekvensene faktisk driver celletypespesifikt genuttrykk i STN, men arbeidet kan være verdifullt i utformingen av fremtidige studier hvor enhancer-sekvenser skal testes gjennom bruk av AAVs.

The subthalamic nucleus (STN) takes part in the Basal ganglia (BG) neural circuit that dysfunctions in Parkinson’s disease (PD) patients resulting in disturbed motor function. Deep brain stimulation (DBS) of STN has been shown to relief motor symptoms, but the mechanism behind is not elucidated. Several optogenetic studies have attempted to mimic the effects of DBS to better understand which sub-groups of neurons and type of stimulation is responsible for the observed effect. However, the limited cell type specificity of applied methods has resulted in inconsistent and conflicting results and it demonstrates the need of a transgenic tool that exceeds the specificity level of existing methods.

The main objective of this thesis was to use a newly established method, Enhancer Driven Gene Expression (EDGE), to test if single enhancers can enable cell-type specific transgene expression in or within STN when transgenic construct is transfected using modified adeno-associated virus (AAV). To identify putative enhancer sequences, we collected and analyzed previously published chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) data. A list of 50 putative enhancer sequences was narrowed down to 8 using criteria related to genetic sequence and associated genes. Next, each putative enhancer sequence was cloned into an AAV vector designed to ensure that any transgene GFP expression would be a result of enhancer activity. From the AAV vectors, EDGE recombinant AAVs (rAAVs) were produced and injected into mouse STN. After processing the brain sections using immunohistochemistry, the anatomical localization of GFP labelled cells in mouse injected with EDGE rAAVs was compared to a universally expressing control virus to answer if the putative enhancers drove expression specific for STN.

Seven injections, including four putative enhancer sequences were evaluated. Three putative enhancers had expression in STN, and two injections of two of the enhancers showed expression exclusively in STN. There are indications of specificity, but at the same time injections with the same vectors in other animals also led to expression outside of the STN, suggesting factors other than the enhancer drive the perceived specificity. The pronounced fiber tracts present in the STN region might influence virus spread and not all injections hit STN. Our current data is unconvincing in either direction but can be valuable in the design of future studies that tests enhancers using AAVs.