Terminally modified alginates as universal tool for its bi-functionalization

Abstract

Alginat er en viktig polysakkarid med et bredt bruksåmråde innen industri og forskning på grunn av dets egne egenskaper. Disse egenskapene inkluderer evne til å lage gel, øke viskositet og løse opp et gelnettverk. Det har vært økende interesse i å tilføye nye funksjoner uten å svekke dets egne egenskaper. Alginat har flere kjemiske grupper tilgjengelig for modifisering, men end-modifisering er et optimalt alternativ.

I den første delen av oppgaven, alginat oligomerer ble funksjonalisert på sin reduserende ende ved hjelp av en amineringsreaksjon og en one-pot reduktiv aminering ved bruk av pikolin boran som et ikke-giftig reduksjonsmiddel. Produktene ble renset på Size-Exclusion Chromatography (SEC), og dannelsen av kovalent binding ved konjugering ble verifisert av Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. End-funksjonalisering av guluronat oligomerer med et dioksyamin og et dihydrazid linker molekyl resulterte i fullstendig reduksjon med dannelse av stabile sekundære aminer. Reaksjoner med begge linkerne førte til høy produktutbytte, men noe lavere produktutbytte (72 %) ble estimert ved konjugering med dihydrazidet sammenlignet med dioxyaminet (95 %). Oksyamin-funksjonalisert mannuronat oligomerer ble fremstilt ved amineringsreaksjon med og uten picolin boran. Aminering uten pikolin boran førte til dannelse av acykliske produkter, (E)- og (Z)-oksimer, med 100% utbytte. To strukturer av hver isomer ble identifisert fra NMR spektra. Med reduksjonsmiddel tilstede, sekundære aminer ble dannet med 100% utbytte. Forskjellen i reduktiv ende reaktivitet mellom guluronat og mannnuronat oligomerer ble funnet basert på reaksjonstiden brukt for fullstendig reduksjon med dioxyaminet, nemlig 96 timer for guluronat og 24 timer for mannuronat.

I den andre delen av studien, et fluoroformolekyl ble konjugert med oligoguluronat, OligoG CF-5/20 (AlgiPharma AS), i en to trinns protokoll. Først, OligoG CF-5/20 ble konjugert med oksyamin gruppen på et polyetylen glykol (PEG)-linker molekyl i en one-pot reduktiv aminering. Deretter, PEG-linkeren ble konjugert med alkyn-funksjonalisert fluorofor i en aklyn/azid kopper-fri klikk-reaksjon. Fluoroformerket OligoG CF-5/20 ble anvend til å "coate" kitosan-baserte nanopartikler. Analysen fra Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) viste tilstedeværelse av fluoroserende populasjoner av nanopartikler. Dette viser vellykket coating og retensjon av alginat evne til å binde kitosan.

I denne proof-of-concept-studien, en vellykket end-modifisering av alginat ble demonstrert med tilføring av ny funksjon samtidig optimal retensjon av egne egenskaper ved bruk av etablerte protokollen. Metoden åpner en rekke nye applikasjoner av polymeren, e.g., i drug delivery og vevsteknologi.

Alginate is an important polysaccharide with a variety of industrial and research applications due to its inherent properties. Some of these properties include the ability to gel, increase viscosity, and dissolve a gel network. It would be interesting to expand alginate’s applications by adding a new function without compromising these properties. There are several chemical groups on alginate available for modification, but terminal modification is the most optimal choice for this purpose.

In the first part of the thesis, the reducing end of alginate oligomers was functionalized by an amination reaction and a one-pot reductive amination reaction, utilizing picoline borane as a non-toxic reducing agent. Products were purified by Size-Exclusion Chromatography (SEC), and the formation of conjugated covalent bonds was verified by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. Terminal functionalization of guluronate oligomers with dioxyamine and dihydrazide linker molecule by one-pot reductive amination resulted in complete reduction and the formation of stable secondary amines. Reactions with both linkers gave high product yield, but conjugation with dioxyamine (95%) was slightly higher-yielding than with dihydrazide (72%). Oxyamine-functionalization of mannuronate oligomers were prepared by amination reaction with the presence and absence of picoline borane. In the absence of picoline borane, a mixture of acyclic products of (E)- and (Z)-oximes were formed with 100% estimated yield. Two structures of each isomer were identified with NMR spectroscopy. In the presence of the reducing agent, secondary amines were obtained with 100% estimated yield. The difference in reducing end reactivity between mannuronate and guluronate oligomers was illuminated by the difference in the required reaction time for complete reduction with dioxyamine, namely 96 h for guluronate and 24 h for mannuronate.

In the second part of the study, a fluorophore molecule was grafted to oligoguluronate, OligoG CF-5/20 (AlgiPharma AS), by a two-step procedure. First, the OligoG CF-5/20 was conjugated by one-pot reductive amination to the oxyamine moiety of a polyethylene glycol (PEG)-spacer molecule with 100% estimated product yield. Thereafter, the PEG-spacer was grafted to an alkyne-functionalized fluorophore by alkyne/azide copper-free click reaction. The fluorescent-labeled OligoG was further applied to coate chitosan-based nanoparticles. Analysis by Nanoparticle tracking analysis (NTA) showed the presence of fluorescently active populations of nanoparticles, demonstrating successful coating and, hence the retention of the alginate’s inherent property to bind chitosan.

In this proof-of-concept study, the terminal modification of alginate using the established protocol demonstrated an effective method to add new functionality to the polymer with optimal retention of its inherent properties. This highly broadens the range of the polymer application, e.g., in drug delivery and tissue engineering.