Persister Quantification is Influenced by Antibiotics and Incubation Media and Formation of Triggered Persistence is Dependent on relA in Escherichia coli

Abstract

Persistere er en ikke-voksende subpopulasjon av celler som er tolerante mot antibiotika. Klassifiseringen av persistere gjenspeiler deres årsak til opprinnelse, hvor spontane persistere dannes stokastisk i en eksponentielt voksende kultur, mens trigget persistere dannes i respons til et eksternt stimulus, for eksempel næringsmangel eller medikamenter. Svikt i antibiotikabehandling og tilbakefall av infeksjoner er assosiert med persistere, og å adressere mekanismene bak deres dannelse er verdifullt for å fremskynde utviklingen av antibiotika. Persisterfeltet er komplisert på grunn av mangelen på en standardisert protokoll. Denne masteroppgaven trekker oppmerksomheten mot et bevisst valg av antibiotika og inkuberingsmedia, ettersom forskjellige persisterfraksjoner var observert ved inkubering av samme kultur i fullstendig M9 og M9 uten nitrogen med ulike antibiotika. Videre forsøk viste at persistere ble selektert for under repeterte antibiotikabehandlinger, noe som indikerer arvelige mekanismer bak persisterdannelse. Deretter er oppgaven fokusert på rollen til RelA i Escherichia coli ettersom dets stressrelaterte produkt (p)ppGpp er involvert i persisterdannelse. Ciprofloxacin persistere ble vist til å være avhengige av RelA i stasjonærfase med karbon- og nitrogenbegrensning, mens spontane persistere var ikke avhengige av RelA. Trigget persistere ble fremdeles dannet under nitrogenbegrensning i fravær av RelA, noe som indikerer ytterligere mekanismer bak persisterdannelse. Analyse av endometabolomet viste at RelA ikke påvirket metabolittmengden i eksponentiellfase, noe som underbygger rollen til RelA som en stressrespons. I tillegg ble den sentrale karbonmetabolismen undersøkt under næringsmangel i villtypen, og den viste lave metabolittkonsentrasjon i både karbon- og nitrogenbegrenset stasjonærfase, men til en mindre grad for sistnevnte. I hovedtrekk har denne oppgaven bidratt til å utvikle en standardisert protokoll, som forhåpentligvis vil bane veien for en mer omfattende og korrekt innsikt i mekanismene bak persisterfenotypen.

Persisters are a non-growing subpopulation of cells exhibiting tolerance to antibiotics. The persister classification reflects their cause of origin, with spontaneous persistence formed stochastically in an exponentially growing culture, while triggered persistence is formed in response to an external stimulus such as nutrient limitation and drugs. Antibiotic failure and recurrence of infections are associated with persistence, and addressing the mechanisms behind their formation is valuable for accelerating the development of antibiotics. The field of persistence is complicated due to the lack of a standardized protocol. This thesis draws attention towards the consistency of antibiotics and incubation media, as different persister fractions were observed when incubating the same culture in M9 and M9 without nitrogen containing various antibiotics. Further experimenting revealed intermittent antibiotic treatments to select for persisters, indicating inheritable mechanisms causing their formation. Subsequently, this work focused on the role of RelA in Escherichia coli as its stress-related product (p)ppGpp is implicated in persister formation. Ciprofloxacin persisters were shown to be dependent on RelA in C-starved and N-starved stationary phase, while spontaneous persistence did not require RelA. However, triggered ciprofloxacin persistence was still formed in N-starvation in the absence of relA, indicating additional mechanisms to underlie the persister formation. Endometabolomic analysis showed RelA to not influence the metabolite pools in exponential phase, supporting the role of RelA as a stress-response. The central carbon metabolism was examined in starvation of the wild-type strain, showing drained metabolite pools for C-starved and N-starved populations, however, to a less extent for the latter. Collectively, this thesis has contributed to developing a standardized protocol, hopefully paving the way for a more comprehensive and accurate insight into the mechanisms behind the persister phenotype.