Studies of antibiotic tolerance in E. coli K12 MG1655 and the influence of the rpoS and relA stress response systems - Mechanisms of tolerance toward ampicillin, streptomycin and ciprofloxacin

Abstract

Forekomst av bakterier med multiresistens mot antibiotika er et økende problem over hele verden og infeksjoner forårsaket av disse organismene fører til ca. 700 000 dødsfall i året. Den raske utviklingen av resistens og toleranse mot allerede eksisterende antibiotikatyper representerer en alvorlig utfordring for folkehelsen. For å motvirke denne negative utviklingen, må nye typer medisiner med nye virkningsmekanismer utvikles i tillegg til nye behandlingsformer. Antibiotikatoleranse, altså mikroorganismers evne til å overleve forbigående eksponering for høye konsentrasjoner av et legemiddel, som ellers ville være dødelig, er hovedfokuset for denne oppgaven. Som naturlige antibiotikaprodusenter har de fleste Bakterier en viss iboende grad av toleranse. Denne fenotypen kan også utvikles i sub-populasjoner som et første forsvar mens bakteriene forbereder seg på utviklingen av resistens. På denne måten bidrar toleranse til å legge til rette for utviklingen av multiresistens. Toleranse er også et fenomen som er nært knyttet til forekomsten av persistere, med reduserte vekstrater og en tilstand av dvale. En rekke iboende stressresponssystemer i bakterier kan bidra til utviklingen av toleranse, og RpoSsystemet og relA-nettverket (p)ppGpp er spesielt viktige. Hovedmålet med dette prosjektet har vært å øke forståelsen av stressresponssystemenes rolle i utviklingen av antibiotikatoleranse. Effekten av tre klasser av antibiotika ble derfor utforsket; henholdsvis med en villtype Escherichia coli K12 MG1655 og to de to knockout stammene ΔrpoS og ΔrelA. Ettersom knockoutene var nye i laboratoriet, ble det først utført eksperimenter for å sammenligne vekstrater og vekstmønster mellom disse og villtypen. Minste hemmende konsentrasjoner (MIC) av 3 typer antibiotika ble bestemt for de tre bakteriestammene inokulert i M9 medium. Resultatene ble videre brukt til å undersøke toleranseresponser i to kultiveringssystemer og med kontinuerlige avlesninger av metabolsk status. Forberedende studier ble utført med en brønnplate-leser for å etablere gunstige forhold for senere mikrobioreaktor forsøk. De tre E. coli-stammene ble behandlet med en rekke konsentrasjoner av antibiotika over og under deres respektive MIC (tilsatt midt i eksponentiell fase). Generelt ble ciprofloxacin observert til å være den mest effektive av antibiotikaene mot alle tre E. coli-stammene, etterfulgt av ampicillin og streptomycin. Videre var knockoutene betydelig mer tolerante mot alle tre antibiotikaene enn villtypen, og spesielt ΔrpoS. Responsen varierte også mye med variasjoner i vekstfasestatus. Det ble klart i løpet av disse studiene at en streng eksperimentell protokoll er nødvendig for å kunne sammenligne MIC mellom de ulike forsøkene og for de ulike bakteriestammene, og videre for å kunne karakterisere toleranseresponser nøyaktig. Denne studien har bidratt med ny kunnskap som vil hjelpe i den videre utforskning av antibiotikatoleranse ved bruk av avansert dyrkingsteknologi (fermentorer). Av særlig interesse er forskjellene mellom antibiotikaresponser i aktivt voksende celler og persistere og vedvarende inaktive kulturer.

Multi drug resistance (MDR) is a rising problem worldwide, with infections by antimicrobial resistant bacteria causing approximately 700 000 deaths annually today. In order to handle this crisis, new antibiotics with novel mechanisms of action needs to be explored, as well as new treatment regimes. However, the fast development of resistance and tolerance toward both antibiotics already in use and novel antibiotics poses a serious challenge. Antibiotic tolerance, the ability of microorganisms to survive transient exposure to high concentrations of a drug that would otherwise be lethal, is the main focus point of this thesis. As natural antibiotic producers, most Bacteria have some inherent degree of tolerance. Tolerance may also develop in sub-populations as a first stage of defence while preparing for the development of resistance, and in that way facilitate the evolution of MDR. It is also a phenomenon which is closely related to persistence, associated with decreased growth rates and dormancy. A range of interrelated stress response systems in Bacteria may contribute to the development of tolerance, and the RpoS system and the general stress response, and the relA (p)ppGpp network are especially important. The main aim of this project was to understand the role of stress systems in antibiotic tolerance responses. The effects of three classes of antibiotics were explored with a wild type Escherichia coli K12 MG1655 strain and two knockouts ΔrpoS and ΔrelA. As the knockout strains were new to the laboratory, experiments visualising their growth rate and pattern were performed in other to determine if they were directly comparable to the wild type. Minimal inhibitory concentrations (MICs) with bacteria inoculated in M9 minimal media, were determined for the three strains with three classes of antibiotics. The results were further used to examine tolerance responses in bacterial cultures in two cultivation systems with continuous read outs of metabolic status. Preparatory studies were performed with a well-plate reader, in order to better establish optimal conditions for high throughput microbioreactor cultivations. Samples of the three E. coli strains were treated a range of sub- and above-MIC concentrations of each of the three antibiotics, which were added in the middle of the exponential phase. In general, ciprofloxacin was found to be the most effective antibiotic against all three strains, followed by ampicillin and streptomycin. Furthermore, the knockout strains were significantly more tolerant toward all the antibiotics than the wild type, and especially ΔrpoS. The antibiotic responses were also seen to vary greatly with variations in growth phase status, which became especially evident in the high-resolution cultivations. It became clear during the course of these studies that a strict protocol is needed in other to determine MICs and characterise tolerance responses more accurately. The observations made in this study will aid the further exploration of the development of antibiotic tolerance in advanced cultivation technology (fermenters). Of particular interest is the distinctions of antibiotic responses between actively growing cells and dormant and persistent cultures.