| dc.description.abstract | Alginater er en familie av lineære polysakkarider som består av 1 → 4 bundet β-D-mannuronsyre (M) og α-L-guluronsyre (G). De to sukkermolekylene er C5-epimerer, noe som betyr at de har ulik stereokjemiske konfigurasjonen rundt karbon nummer fem. Polysakkaridet finnes som en komponent i celleveggen til brunalger (Phaeophyceas) og syntetiseres også av noen rødalger (Rhodophyta) og bakterier fra slekten Azotobacter og Pseudomonas.
I naturen blir alginat først syntetisert som lange kjeder av bare mannuronsyre (poly-M). Deretter blir noen av M-enhetene konvertert til G-enheter av mannuronan C5-epimeraser. Disse enzymene har unike epimeriseringsmønstre, noe som fører til ulike mengder og fordelinger av G-enhetene i alginatkjeden. I tillegg kan alginat acetylaser og alginat lyaser modifisere polymeren ved å henholdsvis feste på acetylgrupper i alginatkjeden og endre kjedelengden til polymeren. Forholdet mellom mengden og fordelingen av G-enheter og acetylgrupper, samt kjedelengden til polymeren, danner grunnlaget for de fysiokjemiske egenskapene til det ferdige alginatet. Disse egenskapene innebærer blant annet dannelse av termostabile hydrogeler, binding av vann og biokompatibilitet, hvilket gjør at biopolymeren er nyttig i en rekke industrielle og biomedisinske anvendelser.
En familie av syv ekstracellulære kalsiumavhengige mannuronan C5-epimeraser (AlgE1-7) har blitt isolert fra bakterien Azotobacter vinelandii. Blant disse syv enzymene har AlgE7 vist seg også å ha lyase aktivitet. En lignende reaksjonsmekanisme har tidligere blitt foreslått for
mannuronan C5-epimeraser og alginat lyaser. De to katalytiske aktivitetene til AlgE7 er derfor antatt å stamme fra et felles aktivt sete i enzymet. Mannuronan C5-epimeraser og alginat lyaser kan brukes til å skreddersy alginat med spesifikke egenskaper in vitro. En forståelse av funksjonen til disse enzymene muliggjør derfor mer kontrollert design av alginat.
Formålet med dette arbeidet er få en bedre forståelse av den bifunksjonelle aktiviteten til mannuronan C5-epimerase og alginat lyase AlgE7 fra A. vinelandii. Et mutasjonsstudie ble utført ved design av AlgE7 mutanter. Dette ble gjennomført ved å introdusere punktmutasjoner i ulike aminosyrer nær det aktive sete. Totalt ble 42 forskjellige mutanter, som representerer mutasjoner av 18 forskjellige aminosyrer, inkludert i studiet. 31 av disse mutantene har blitt konstruert i tidligere studier ved NTNU, mens 11 av mutantene ble designet i dette studiet ved bruk av sete-spesifikk mutagenese. En kvalitativ analyse av lyase aktiviteten til alle mutantene ble først gjennomført. Deretter ble 25 av mutantene og villtypen tatt med til videre analyse av både epimerase og lyase aktiviteten. Til slutt ble en av mutantene (R148G) og AlgE7 villtypen produsert og renset ved bruk av rekombinant protein uttrykk. Disse to enzymene ble karakterisert i form av reaksjonsprodukter og ”mode of action” ved å bruke 1H-kjernemagnetisk resonans (NMR) og tidsoppløst 13C-NMR.
Resultatene fra dette arbeidet samsvarer med tidligere studier som viser at AlgE7 både har epimerase og lyase aktivitet. Videre ble også enzymenes ”mode of action” på både poly-M og alternerende poly-MG-substrat bekreftet. Imidlertid ble det ikke observert lyase aktivitet på substratet bestående av oligomerer av kontinuerlige G-enheter (oligo-G). Kuttesetene G↓MM, G↓GM, M↓MM og M↓GM for AlgE7 ved reaksjon på poly-M som har blitt foreslått i tidligere studier stemmer også overens med resultatene i dette studie. Derimot kunne ikke en preferanse for lyase aktivitet foran en G- eller en M-enhet bestemmes.
Av alle mutantene som ble undersøkt i dette studiet skilte mutant R148G seg ut fra de andre mutantene ettersom den viste en sterkt redusert lyase aktivitet, samtidig som den fortsatt viste epimerase aktivitet. Basert på dette resultatet har det blitt foreslått at aminosyren R148 påvirker lyase aktivitet ved å tiltrekke seg protonet som er festet til den katalytiske aminosyren Y149, på grunn av sin basiske karakter. Ved å videre anta at aminosyren Y149 er protondonoren i det tredje trinnet av epimeriseringsmekanismen, har det blitt foreslått at aminosyren R148 kan hindre at protonet blir donert til mannuronan og dermed føre til tidvis kløyving av alginatkjeden istedenfor epimerisering. For å undersøke denne teorien nærmere, har det blitt foreslått en videre analyse av pKa verdiene til aminosyrene i det aktive setet. I tillegg er det foreslått at mutasjonsstudier av aminosyre 148 i de andre epimerasene kan gi mer innsikt i hvordan denne aminosyren bidrar til lyase aktiviteten i AlgE7. | |
| dc.description.abstract | Alginates are a family of linear polysaccharides composed of 1 → 4 linked β-D-mannuronic acid (M) and α-L-guluronic acid (G) monomers. The two sugar molecules are C5-epimers, meaning that they only differ in the stereochemical configuration around carbon number five. The polysaccharide is found as a constituent of the cell walls of brown algae (Phaeophyceas) and is also synthesised by some red algae (Rhodophyta) and bacteria of the Azotobacter and Pseudomonas genera.
All natural alginate is initially synthesized as long chains of mannuronic acid (poly-M). Then, some of the M-residues are converted into G-residues by mannuronan C5-epimerases. These enzymes have their unique epimerization patterns, giving rise to different amounts and distributions of G-residues in the alginate chain. In addition, alginate acetylases and alginate lyases can modify the polymer by introducing acetyl groups in the alginate chain or alter the polymer length. The relative content and distribution of G-residues, acetyl-groups and the length of the polymer determine the physiochemical properties of the final alginate. These properties include thermostable hydrogel formation, water binding and biocompatibility, which make the biopolymer useful in a variety of industrial and biomedical fields.
A family of seven extracellular calcium-dependent mannuronan C5-epimerases (AlgE1-7) has been isolated from the bacterium Azotobacter vinelandii. Among the seven enzymes, AlgE7 has also been found to display lyase activity. Mannuronan C5-epimerases and alginate lyases have been proposed to have a similar reaction mechanism. The dual catalytic activity of AlgE7 is therefore thought to originate from the same active site in the enzyme. Mannuronan C5-epimerases and alginate lyases can be used to tailor alginate of specific properties in vitro. An understanding the action of these enzymes thus allows for more controlled design of alginate.
The present work aims to get a better understanding of the bifunctional activity of the A. vinelandii mannuronan C5-epimerase and alginate lyase AlgE7. A mutational study was performed by design of AlgE7 mutants, introducing point mutations in different residues near the active site. A total of 42 different mutants, covering mutations in 18 different residues, were included. 31 of the mutants were constructed in previous studies at NTNU and 11 of the mutants were designed in this study using site-directed mutagenesis. A qualitative assessment of the lyase activity in all mutants was conducted, before 25 mutants and the wild type were selected for further analysis of the epimerase and lyase activity. Finally, one of the mutants (R148G) and the AlgE7 wild type were produced and purified using recombinant protein expression. These two enzymes were characterized in terms of reaction products and the mode of action using 1H-nuclear magnetic resonance (NMR) and time-resolved 13C-NMR.
The result of this work supported previous findings of the AlgE7 epimerase displaying both epimerase and lyase activity. Furthermore, the action on both poly-M and alternating poly-MG substrates was confirmed, whereas no lyase activity was detected on oligomers of continuous G-residues (oligo-G). The previously proposed cleavage sites G↓MM, G↓GM, M↓MM and M↓GM for AlgE7 when acting on poly-M were also seen in this study. However, a clear preference in front of a G- or a M-residue could not be determined.
Among all mutants included in the study mutant R148G stood out as different having a strongly reduced lyase activity compared to the wild type, while still displaying epimerase activity. Based on this result, residue R148 has been hypothesized to have a role in attracting the proton at the catalytic residue Y149, due to its alkaline character. By assuming that residue Y149 acts as the proton donor in the third step of the epimerization mechanism it has been proposed that residue R148 may disrupt the donation of the proton to mannuronan, and thus lead to occasionally cleavage of the alginate chain instead of epimerization. To further investigate this theory analysis of pKa values of the residues in the active site have been suggested. In addition, mutational studies of residue 148 in the other epimerases are suggested to give more insight to the role of this residue concerning lyase activity in AlgE7. | |
