Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorBjørkøy, Geir
dc.contributor.advisorSchmidt, Christa
dc.contributor.advisorSvaasand, Eva
dc.contributor.authorSkulberg, Magnus Barnholt
dc.contributor.authorAndreassen, Kristoffer Emil
dc.date.accessioned2020-07-07T16:09:36Z
dc.date.available2020-07-07T16:09:36Z
dc.date.issued2020
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11250/2661295
dc.description.abstractTrypsinogen er et proenzym som omdannes til det viktige fordøyelsesenzymet trypsin i mange arter, deriblant mennesket. Genene som koder for de tre isoformene til trypsinogen er serin protease 1, 2 og 3, forkortet PRSS1, PRSS2, og PRSS3. Av ulike grunner kan det skje sekvensendringer i PRSS1-genet som kan øke aktiviteten til, eller hindre nedbrytningen av trypsin. Dette kan gi irritasjon i vevet i bukspyttkjertelen (pankreas) hvor cellene som produserer trypsinogen ligger. Over tid kan irritasjon i pankreas lede til utvikling av kronisk pankreatitt, som pasienter med genfeil i PRSS1-genet kan utvikle 20-30 år tidligere enn «normalbefolkningen». Kronisk pankreatitt medfører en forhøyet risiko for utvikling av pankreaskreft (1), og pasienter med påvist genfeil vil få tilbud om tettere oppfølging og kontrollopplegg. I Norge utgjør pankreaskreft 2,6% av alle nye krefttilfeller og 7,1% av alle kreftdødsfall (2). Årlig diagnostiseres rundt 900 personer, oftest nær 70 år, med pankreaskreft. Noen kan ha genetiske predisposisjoner og utvikle kronisk pankreatitt også i svært ung alder (3,4), med flesteparten av PRSS1-relaterte pankreaskreft tilfeller rundt 55 år (5). Når diagnosen er stilt er 80-85% av tilfellene ikke reelt mulig å behandle med kirurgisk kurative inngrep. Dette er begrunnet med et aggressivt vekstmønster og anatomisk nærhet til andre livsviktige organer, slik at pasienter kun vil få palliativ behandling (6). I Norge er fem års overlevelse med pankreaskreft 10,9% for menn og 10,5% for kvinner (2). Pankreaskreft har høy dødelighet med en gjennomsnittlig overlevelsestid på under 1 år etter diagnosetidspunkt og under 6 måneder ved metastasert kreft (2,7). Det er både klinisk og etisk sett essensielt med egnet analysemetode for påvisning av genfeil i PRSS1-genet. Hovedoppgaven til laboratoriet ved Avdeling for medisinsk genetikk (AMG) er å påvise årsak til genetisk sykdom og benytter i dag nestegenerasjonssekvensering (NGS) til diagnostikk. PRSS1-genet er inkludert i NGS genpanelet: «NGS-bukspyttkjertelkreft-CNV». I genomet tilhører PRSS1-genet en genfamilie bestående av pseudogener og gener med områder som har store likheter, kalt homologe sekvenser. NGS teknologien kan forveksle avleste sekvensdata mellom PRSS1 og lignende sekvenser, noe som gir usikkerhet i påvisningen av varianter i PRSS1-genet. En årsak til kronisk pankreatitt er forflyttelse av ett ekson fra PRSS2-genet inn i PRSS1-genet kjent som genkonversjon (4). Genkonversjon kan ikke detekteres i NGS da avleste sekvensdata ikke tilordnes PRSS1-, men PRSS2-genet, og en årsak til pankreatitt kan bli oversett. På grunn av overnevnte problematikk er NGS-analysen ikke lenger vurdert som pålitelig ut ifra et ståsted om medisinsk nytteverdi. Hensikten med bacheloroppgaven var å designe og etablere en målrettet analysemetode for PRSS1-genet ved hjelp av long-range PCR. Til utprøving og validering av metoden ble 4 blodbankprøver benyttet som normalkontroller. Vi lyktes med å bestemme long-range PCR program-innstillinger og designe primere som kun oppformerte PRSS1-genet. Produktet ble sjekket med agarose gelelektroforese og videre nukleotidsekvensert med designede sekvenseringsprimere for å bestemme DNA-sekvensen. Metoden ble validert med analyseprogrammene Sequence Scanner 2 (vurdering av datakvalitet) og Sequence Pilot (sekvensanalyse og vurdering av kvalitet). Siden patogene sekvensvarianter muligens har blitt oversett, ble alle PRSS1-rekvirerte analyser med indikasjonen pankreatitt reanalysert med vår metode for å gi svar på om det ble oversett/ikke påvist sykdomsgivende sekvensvarianter i NGS. Det ble funnet totalt to forskjellige normalvarianter i pasientprøvene med vår metode. Fra NGS dataene ble det funnet totalt 35 ulike varianter. Vi har dermed lyktes med å etablere en målrettet long-range PCR metode som økte nøyaktigheten i påvisningen av klinisk relevante varianter i PRSS1-genet betydelig.
dc.description.abstractTrypsinogen is a proenzyme that converts to the important digestive enzyme trypsin in many species, including humans. The genes encoding the three isoforms of trypsinogen are serine proteases 1, 2, and 3, abbreviated PRSS1, PRSS2, and PRSS3. For various reasons, sequence changes may occur in the PRSS1-gene that increase activity or prevent trypsin degradation. This can cause tissue irritation in the pancreas where the trypsinogen producing cells are located. Given time, this can lead to the development of chronic pancreatitis, which patients with gene defects in the PRSS1-gene may develop 20-30 years earlier than the "normal population". Chronic pancreatitis carries an increased risk of developing pancreatic cancer (1). Patients with proven gene defects will be offered closer follow-up and control procedures. In Norway, pancreatic cancer accounts for 2.6% of all new cancer cases and 7.1% of all cancer deaths (2). Each year, approximately 900 people is diagnosed with pancreatic cancer, usually around 70 years of age. Some may have genetic predispositions and develop chronic pancreatitis at a very young age (3,4), with most PRSS1-related pancreatic cancer cases around 55 years of age (5). When diagnosed, 80-85% of cases are not possible to treat with surgical curative intervention. This is justified by an aggressive growth pattern and anatomical proximity to other vital organs, so that patients will receive palliative treatment only (6). In Norway, five years of pancreatic cancer survival is 10.9% for men and 10.5% for women (2). Pancreatic cancer has a high mortality rate with an average survival time of less than 1 year after diagnosis and less than 6 months in metastatic cancer (2,7). A suitable analytical method for detecting gene defects in the PRSS1-gene is not only clinically and ethically important, but to some; essential. The main task of the laboratory at the Department of Medical Genetics (Avdeling for Medisinsk Genetikk - AMG) in Trondheim University Hospital, Norway, is to identify the cause of genetic disease and uses next-generation sequencing (NGS) for today’s diagnostics. The PRSS1-gene is included in the NGS gene panel: "NGS pancreatic cancer CNV". The NGS technology is showing signs of mixing PRSS1-reads with reads derived from pseudogenes and similar sequences in the same gene family in the genome, called homologous sequences. This leads to uncertainty in the detection of variants in the PRSS1-gene. One cause of chronic pancreatitis is the transfer of one exon from the PRSS2-gene into the PRSS1-gene known as gene conversion (4). NGS is not able to detect gene conversion as reads cannot be assigned to the PRSS1-gene, only PRSS2, effectively overlooking a cause of pancreatitis. Due to the aforementioned problems, the NGS analysis is no longer considered reliable from a medical utility point of view. The purpose of the bachelor thesis was to design and establish a targeted assay method for the PRSS1-gene using long-range PCR. For testing and validation, 4 blood bank samples were used as controls. We succeeded in determining long-range PCR settings and designing primers that amplified only the PRSS1-gene. The product was checked by gel electrophoresis and further Sanger sequenced with designed sequencing primers to determine the DNA-sequence. The method was validated using the Sequence Scanner 2 (data quality assessment) and Sequence Pilot (sequence analysis and quality assessment). Since pathogenic variants may have been overlooked in NGS earlier, all PRSS1 requisition assays indicated with pancreatitis were reanalyzed with our method. A total of two different normal variants were found in the patient samples using our method. From the NGS data a total of 35 different variants were found. We have thus succeeded in establishing a targeted long-range PCR method that significantly increased the accuracy of detection of clinically relevant variants in the PRSS1-gene.
dc.publisherNTNU
dc.titleMetodeetablering av long-range PCR for nøyaktig påvisning av klinisk relevante varianter i PRSS1-genet.
dc.typeBachelor thesis


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel